緒言

　アミノ酸は調味料、飼料添加物、医薬品原料、化成品原料など幅広い用途に用いられ、その需要は年々高まっている。現在多くのアミノ酸はCorynebacterium glutamicumやEscherichia coli(E. coli)などの微生物を用いた発酵法により生産されている。これらの微生物を用いて発酵を行うにあたり、生産菌の能力向上は製造コスト削減、環境負荷の低減に対して重要である。これまでに、生産菌の開発は、主に最終生産物による代謝阻害・抑制の解除や目的生産物への生合成経路の強化、不要な副生物の生成経路の遮断を行うことにより行われてきた。

　一般的に発酵微生物による目的産物の生成は培地中の要求アミノ酸などの枯渇により定常期に移行した後に培地中に著量蓄積されるようになるが、生産速度は定常期初期においては高いものの、経時的に低下する傾向が認められる。工業生産上は、生産速度が最大値のまま一定に保たれることが望ましく、定常期での目的物質の生産速度の維持は、工業生産に耐え得る生産菌においては重要な形質である。

　一方、微生物はストレス環境下での生存、あるいは恒常性の維持のため、様々なストレス応答機構を有している。これらの因子は微生物の増殖、代謝に大きな影響を及ぼしており、目的物質の生成能の経時変化から考えて、これらの機構が発酵生産能に対しても正負両面から影響していることが推察される。しかしながら、これらがアミノ酸等の発酵生産に対して実際にどのように作用しているのかについての知見は乏しい。

　そこで、本研究ではリジン、グルタミン酸などのアミノ酸を過剰生成するE. coli変異株を用いたアミノ酸発酵過程で発生していると考えられるストレス、具体的には定常期、要求アミノ酸飢餓への応答に関与する因子の発酵生産能へ及ぼす影響を遺伝子発現の面から解析を行い、更に発酵生産能の制御に寄与していると考えられる遺伝子の増幅株、欠損株を構築し、それらの株の諸性質について検討を行った。

1.　定常期特異的に発現するrmf遺伝子の破壊による発酵生産能向上

　まず、本研究では定常期に特異的に発現が上昇する遺伝子群の中に、発酵生産速度の維持を阻害する何らかの因子があるという仮説を立て、本因子を不活性化することで目的とする形質を備えたような生産菌を取得することを試みた。そこで、様々な培地、培養条件でE .coli野生株を培養し、増殖期、および定常期での遺伝子発現のプロファイリングをDNAマクロアレイを用いて行い、共通して定常期において特異的に発現が上昇する遺伝子を抽出することを試みた。その中でいずれの条件でも非常に強く定常期において発現が上昇する遺伝子の一つとしてrmf遺伝子を見出した。本遺伝子産物であるRMF(Ribosome Modulation Factor)タンパクは、リボソームを2量体化し、その翻訳活性を停止させることが知られている。このようなRMFタンパクの機能から、定常期においてはRMFタンパクの増加によりアクティブなリボソームの数が減少することにより目的物質への生合成経路の酵素の新規合成が低下し、結果として生産速度が低下しているのではないかと仮定した。

　そこで、E. coliのリジン過剰生成株WC196よりrmf遺伝子の破壊株を取得し、そのリジン生産能の評価を行った。その結果、本遺伝子の破壊株は元株に比較して定常期でのリジンの生産能が大きく向上することが認められた(図1)。同様の効果はグルタミン酸生産菌においても認められ、定常期において、RMFタンパクの増加によるリボソームの不活性化がE. coliを用いたアミノ酸発酵生産において生産速度の低下をもたらす因子であることが示唆された。

2.　rmf遺伝子破壊株の特性解析と酵素発酵生産への応用

　次に、本研究ではrmf遺伝子破壊のこの他の発酵生産菌開発への応用展開を図ることを考え、rmf遺伝子破壊株において高発現している遺伝子を網羅的に探索することにした。その結果、興味深いことにrmf遺伝子破壊株においては、培地中のリン酸の有無に関わらず、リンが枯渇したときに野生株が示す遺伝子発現プロファイルと非常に類似した遺伝子発現パターンを示すことが明らかとなった。具体的には、リボソームタンパクをコードする遺伝子群の発現が顕著に低下していること、リンが枯渇したときに発現することが知られているPhoレギュロン遺伝子群が常時高発現していることが確認された。Phoレギュロンの遺伝子はPhoR-PhoB 2成分制御系の制御タンパクPhoBが結合する配列(Pho box)をプロモーター配列の近傍に有する。そこで、Phoレギュロンの遺伝子の遺伝子産物であるアルカリフォスファターゼの活性を調べたところ、rmf遺伝子破壊株では酵素活性が増加していることが確認され、この現象はアルカリフォスファターゼをコードするphoA遺伝子が自分自身のプロモーターによって発現されているときに認められ、ラクトースやアラビノース存在下において発現が誘導されるようなプロモーターなど、他のプロモーターの制御下で発現されているときはこの現象は認められないことが確認された。

　この結果と、RMFタンパクの機能はリボソームの2量体化による翻訳活性の阻害であること、菌体内のリボソーム量はフィードバック制御により厳密に制御されていることなどを考慮すると、リボソーム生合成機構とリン代謝機構の間に、これまで知られていない新規の制御機構が存在することが示唆された。

　更に、この知見を産業上に応用することを考え、Morganella morganiiの酸性フォスファターゼの生産に応用することを試みた。本酵素は酸性フォスファターゼであるとともに、イノシン、グアノシンなどのヌクレオシドとピロリン酸から5'-IMP、5'-GMPなどのうまみ物質として知られるヌクレオチド類を生成する反応を触媒することが知られており、工業的に有用な酵素である。Morganella morganii由来の酸性フォスファターゼをコードするphoC遺伝子のORF上流域にはPho boxと相同な配列が存在しており、rmf遺伝子破壊株を利用することで本酵素の生産能が向上することが期待される。実際にrmf遺伝子破壊株において本酵素を発現させたところ、対照に比較して酵素生産量が1.5〜2倍向上することが確認された(図2)。

3.　緊縮応答とアミノ酸生産との関連解析

　上記のように、rmf遺伝子は定常期においてアミノ酸、酵素などの発酵生産能を抑制する因子として機能していることが明らかとなってきた。rmf遺伝子の発現は、菌体内のシグナル分子であるppGpp(グアノシン-3',5'-2リン酸)により正に制御されることが報告されている。ppGppは、微生物がアミノ酸飢餓などのストレスにさらされたときに生成され、いわゆる緊縮応答を誘導することが知られている。一方、アミノ酸生産菌はその育種過程において、目的とする生成物への代謝経路の強化や不要な副生物生成経路の遮断、あるいは発酵過程における菌体量の制御などを目的として、結果としてアミノ酸要求性を付与されているものが多い。したがって、発酵過程中に要求アミノ酸の飢餓が発生し、菌体内にppGppが蓄積するような状況になっていると推測される。しかしながら、ppGppの蓄積がアミノ酸発酵に対して正の効果があるのか、負の効果があるのかは未だ不明である。

　そこで、ppGpp合成酵素をコードするrelA遺伝子、spoT遺伝子の破壊株、増幅株をアミノ酸生産菌より取得し、その影響を解析した。その結果、E. coliのグルタミン酸過剰生成株のrelA遺伝子破壊株においては、生育、グルタミン酸生産量は大きく低下した。一方、relA遺伝子過剰発現株においては、グルタミン酸生産能は顕著に上昇した(表1)。relA遺伝子過剰発現によるアミノ酸生産能向上は、グルタミン酸過剰生成株だけでなくリジン過剰生成株においても認められ、ppGppがアミノ酸発酵が成立するためには必須の因子であるということが示唆された。

　更に、グルタミン酸過剰生成株とそのrelA遺伝子破壊株、過剰発現株を要求アミノ酸が充足、あるいは枯渇した条件で培養を行い、そのときの生育、グルタミン酸生産、菌体内のppGpp蓄積の関係を解析した。その結果、菌体内ppGppの蓄積と、グルタミン酸生産量の間には正の相関関係が認められた(図3)。以上の結果から、要求アミノ酸の枯渇に伴う菌体内ppGpp蓄積の上昇が、グルタミン酸過剰生産を誘導することが示唆された。

結論

　本研究においては、Escherichia coliのアミノ酸過剰生産株を用いたアミノ酸発酵生産過程で発生していると考えられるストレスに着目し、特にこの中で定常期における翻訳機能の抑制を担うrmf遺伝子、アミノ酸飢餓応答に関与するrelA遺伝子に着目し、これらの遺伝子産物がアミノ酸発酵生産過程において及ぼす影響について解析を行った。その結果、rmf遺伝子の発現が定常期の発酵生産能の低下に関与していることを明らかにした。また、要求アミノ酸の枯渇に伴いrelA遺伝子産物により合成されるppGppが菌体内に蓄積することにより、アミノ酸の過剰生成が誘導されることを明らかとした。以上のことから、これまで明らかになっていなかった微生物によるアミノ酸過剰生成機構は、これまで考えられていたような代謝経路の変異などだけでなく、微生物の環境応答にも大きく依存していることが示唆された。

図1.　rmf遺伝子破壊株のリジン生産

図2.　rmf遺伝子破壊株の酸性フォスファターゼ活性

表1　グルタミン酸生成菌MG1655SとそのrelA遺伝子破壊株(MG1655SA)の生育(OD(600))とグルタミン酸生産へ及ぼす影響relA遺伝子増幅効果

pM15:ベクターのみ、pMrelA':truncated relA遺伝子増幅プラスミド、pMrelA:relA全長増幅プラスミド　Y(p/s):対消費糖グルタミン酸重量収率　p value:Y(p/s)の対象に対するt検定の結果

括弧内の数字は標準偏差(n=3)を示す

図3　グルタミン酸生成菌における菌体内ppGpp蓄積とグルタミン酸生産量との関係

エラーバーはn=3の標準偏差を示す

　アミノ酸は調味料、飼料添加物、医薬品原料、化成品原料など幅広い用途に用いられ、その需要は年々高まっている。現在多くのアミノ酸はCorynebacterium glutamicumやEscherichia coliなどの微生物を用いた発酵法により生産されている。従来、アミノ酸生産菌の開発は最終生産物による代謝阻害・抑制の解除や、目的生産物への生合成経路の強化、不要な副生物の生成経路の遮断を行うことなどにより行われてきた。一方で、このような手法により取得された生産菌においては、目的物質の生産速度は増殖定常期初期において最大に達した後、経時的に低下する傾向が認められる。工業生産上、生産速度は最大値のまま一定に保たれることが望ましく、増殖定常期での目的物質の生産速度の維持は、工業生産に耐え得るアミノ酸生産菌における重要な形質となっている。本論文は、E.coliのアミノ酸過剰生成株を用い、アミノ酸発酵過程で発生しているストレス、具体的には増殖定常期、要求アミノ酸飢餓への応答に関与する因子の発酵生産能へ及ぼす影響を解析し、工業生産菌株の新たな育種方法について検討を行ったもので、緒論とそれに続く3章からなる。

　緒論において研究の背景を述べた後、第1章においては様々な培養条件でE. coli野生株を培養した際に、増殖定常期に特異的に発現が上昇する遺伝子群についてDNAマクロアレイを用いて抽出することを試みた。その中でいずれの条件でも非常に強く増殖定常期での発現が上昇する遺伝子の一つとしてrmf遺伝子を見出した。本遺伝子の産物であるRMF(Ribosome Modulation Factor)タンパク質は、リボソームを2量体化することで翻訳活性を停止させることが知られており、アミノ酸生産能を低下させる因子となっていることが考えられた。そこで、E. coliのリジン過剰生成株WC196よりrmf遺伝子の破壊株を取得し、そのリジン生産能の評価を行った。その結果、rmf遺伝子の破壊株では増殖定常期でのリジンの生産能が大きく向上することが認められた。

　第2章においてはrmf遺伝子破壊株の培養特性を解析し、リン欠乏時における増殖のrmf欠損による変化を見出した。更に遺伝子発現解析を行った結果、遺伝子破壊株においては、リボソームタンパク質をコードする遺伝子群の発現が低下していること。また、リンが枯渇したときに発現することが知られているPhoレギュロン遺伝子群が恒常的に高発現していることが見いだされた。この結果と、RMFタンパクの機能、菌体内のリボソーム量制御機構などを考慮し、リボソーム生合成機構とリン代謝機構の間に、これまで知られていない新規の制御機構が存在することを示唆した。更に、工業的に有用な酵素であるMorganella morganii由来の酸性フォスファターゼのE. coliを用いた発現系について、宿主E. coliのrmf遺伝子を破壊することで、その生産量が1.5〜2倍向上することを示している。

　第3章においては、rmf遺伝子の発現を正に制御することが知られているppGpp(グアノシン-5'二リン酸3'二リン酸)に着目した解析を行っている。ppGppは、バクテリアがアミノ酸飢餓などのストレス条件下で菌体内に蓄積し、緊縮応答を誘導する。アミノ酸生産菌はその育種の結果アミノ酸要求性を示す株が多いため、発酵過程中に要求アミノ酸の飢餓によりppGppが蓄積していると推測される。しかしながら、ppGppの蓄積がアミノ酸発酵に対する影響は未だ不明である。そこで、ppGpp合成酵素をコードするrelA遺伝子の破壊株・増幅株を構築し、その特性を解析した。その結果、グルタミン酸過剰生成株のrelA遺伝子破壊株においては、生育が阻害されるとともに、グルタミン酸生産量が大きく低下していた。一方、relA遺伝子過剰発現株においては、グルタミン酸生産能が顕著に上昇した。relA遺伝子過剰発現によるアミノ酸生産能向上は、リジンなどの過剰生成株においても認められ、ppGppはアミノ酸発酵が成立するための必須の因子であることが示唆された。更に、要求アミノ酸の枯渇に伴う菌体内ppGpp蓄積の上昇が、グルタミン酸過剰生産を誘導することを示す結果を得ている。

　以上、本論文は、E. coliのアミノ酸過剰生産株を用いたアミノ酸発酵生産過程において、rmf遺伝子が増殖定常期の発酵生産能の低下に関与していること。さらに、要求アミノ酸の枯渇に伴いrelA遺伝子産物により合成されるppGppが菌体内に蓄積し、アミノ酸の過剰生成が誘導されることを明らかとしたもので、バクテリアによるアミノ酸過剰生産が、従来考えられていたような代謝経路の変異等のみならず、より普遍的な生理的調節機能にも大きく左右されることを示唆している。これらの知見は学術上、また応用上極めて価値の高いものであり、よって審査委員一同は本論文が博士(農学)に値するものと認めた。