電気生理学的検討の過程でCCK_B受容体を介する反応の脱感作を見出した。他のG-タンパク共役型受容体の脱感作にセリン/スレオニンキナーゼの関与が見出されており、CCKによるCa²⁺電流抑制作用への関与が示唆されたSta感受性プロテインキナーゼが負のフィードバックとしての脱感作にも関連するのではないかと考えた。しかし、この点についてCCK_B受容体に関しては全く報告が無かった事から、同受容体を持ち簡便にアッセイが可能な株化細胞GH₃細胞を用いて検討を行った。

　この細胞にCCK-8(1M)を適用すると[Ca²⁺]_iおよびIP₃濃度上昇が認められ、これらのCCK惹起反応は、CCK-8前処置により脱感作を受けた。CCK-8処置による脱感作からの回復はホスファターゼ阻害剤calyculin A(100nM)により有意に遅延し、脱感作へのセリン/スレオニンキナーゼの関与が示唆された。また、CCK惹起反応は、ホルボールエステル前処置によっても抑制された。CCK-8前処置による脱感作に対するSta(100M)の影響を調べると、程度は小さいが有意な抑制が認められた。

　以上より、脱感作へのSta感受性プロテインキナーゼの関与が示唆されたが、その程度は比較的弱く他の機構の参与も推測された。

　細胞レベルでのCCKの作用を検討し、以下に示す中枢型CCK受容体を介する神経細胞機能修飾についての新知見を得た。

　CCKは、神経細胞のCCK_B受容体を介し、

　(1)2種のK⁺電流(リークK⁺およびCa²⁺依存性K⁺電流)を抑制し脱分極および後過分極抑制を起こし神経細胞の興奮性増大に関与する事を見出し、Ca²⁺依存性K⁺電流抑制の機序にstaurosporine感受性プロテインキナーゼを介したCa²⁺電流抑制の関与が示唆された。

　(2)また、Glu惹起神経細胞傷害に対する保護効果を見出し、その機序にGlu惹起[Ca²⁺]_i上昇抑制の関与が示唆された。

　さらに、GH₃細胞を用い、

　(3)CCK_B受容体の脱感作にstaurosporine感受性プロテインキナーゼを含む複数の経路の関与が示唆された。

　以上の結果から、神経細胞レベルでCCKは、CCK_B受容体を介しそれぞれ異なった機序により神経細胞の興奮性上昇と神経細胞保護効果を示す事が明らかとなった。

　海馬CA1野錐体細胞においてCCKにより引き起こされる膜電位変化とその機序をパッチクランプ全細胞記録法により調べた。培養および急性海馬切片CA1野錐体細胞から膜電位を記録し、CCK-8を適用すると脱分極反応および後過分極抑制が認められた。この作用は、CCK_B受容体アゴニストのCCK-4でも認められ、また、同受容体アンタゴニストの(+)L-365,260によって消失することから、CCK_B受容体を介する反応であることが明らかとなった。

　CCK-8により誘起される脱分極に対応する内向き電流は、膜抵抗の増大を伴い、逆電位がK⁺イオンの平衡電位に近く、また、直線的な電位依存性を示したことから、リークK⁺電流のCCK-8による抑制に起因する電流であると判断された。また、後過分極に対応する電流成分(後過分極電流)は、K⁺イオンの平衡電位に近い逆転電位を持ち、Ca²⁺チャネルを遮断するCd²⁺の適用で消失したことから、Ca²⁺依存性K⁺電流であり、CCK-8はこの電流を抑制することが示された。

　CCKによるCa²⁺依存性K⁺電流抑制の機序としては、CCKが高閾値型電位依存性Ca²⁺電流を部分的に抑制することが示された。さらに、細胞内液のGTPをGTPSあるいはGDPSに置換すると、CCK-8の抑制効果はそれぞれ増大および消失したことから、この作用はG-タンパクを介するものであることが示された。また、ホスファターゼ阻害剤であるオカダ酸の細胞内適用により抑制作用が増大し、プロテインキナーゼ阻害剤staurosporineによって作用が消失したことから、CCKによるCa²⁺電流抑制作用へのstaurosporine感受性プロテインキナーゼの関与が示唆された。

　個体レベルで、脳虚血後の神経細胞傷害がCCK類縁ペプチドにより抑制されることが報告されていた。一過性脳虚血による神経細胞傷害はグルタミン酸(Glu)の過剰遊離による興奮毒性と考えられている。そこで、培養神経細胞のGlu惹起細胞傷害に対するCCKおよび類縁ペプチドの作用について検討した。

　ラット胎仔脳より得た培養神経細胞にGluを適用し、損傷を受けた細胞より培養液中に漏出する細胞質酵素lactate dehydrogenase(LDH)の活性を傷害の指標とした。CCK-8や類縁ペプチドのceruletideは、GluによるLDH漏出を用量依存的に抑制した。また同様な作用は、CCK_B受容体アゴニストのgastrin-Iでも認められ、同受容体アンタゴニストの(+)L-365,260によって消失することから、CCK_B受容体を介することが明らかとなった。

　培養神経細胞におけるGlu惹起[Ca²⁺]_i上昇に対するCCKの作用を検討したところ、CCK-8およびceruletideは、Glu惹起[Ca²⁺]_i上昇を用量依存的に有意に抑制した。その用量-反応関係がGlu惹起傷害抑制効果のそれに近かったことから、細胞傷害抑制が[Ca²⁺]_i上昇抑制によることが示唆された。また、薬理学的検討によりこの作用がCCK_B受容体を介することが明らかとなった。

　以上の研究の過程でCCK_B受容体を介する反応の脱感作を見出した。その機序を、同受容体を持ち簡便にアッセイが可能な株化細胞GH3細胞を用いて、調べた。

　CCK-8により惹起される[Ca²⁺]_iおよびIP₃濃度の上昇はCCK-8前処置により減弱(脱感作)した。CCK-8前処置による脱感作は、staurosporineにより抑制され、脱感作からの回復はホスファターゼ阻害剤calyculin Aにより遅延した。このことより、脱感作の少なくとも一部には、staurosporine感受性プロテインキナーゼが関与することが示された。

　以上、本研究は、神経細胞レベルにおけるCCKの作用を検討し、中枢型CCK_B受容体を介する神経細胞機能修飾についての新知見を加えたものであり、神経科学の発展に寄与するところがあるものと認められ、博士(薬学)の学位論文に値するものと判断した。