上流因子の解析を行うに当たり、形質転換植物作成に用いたプロモータ領域が組織特異的発現に必要十分な領域を含んでいるかを確かめるため、各遺伝子特異的な³⁵SラベルcRNAプローブを用いて、常温のシロイヌナズナ花冠部でin situ hybridizationを行った(図5)。センスおよび81-1プローブでは有意な組織特異的なシグナルは認められないが、81-2,81-3アンチセンスプローブでは雄蕊の原基および葯の内部に強いシグナルが認められ,GUS組織化学染色の結果と矛盾しなかった。これにより、この領域が器官特異的な転写制御領域を含んでいると考えられるため、この領域を用いて上流因子の検索を行うこととした。

　上流因子の検索においてはサウス・ウエスタン法などが用いられ、実際に複数の転写因子がクローニングされている。しかしながら、この方法はかなり強い相互作用を持つものしか単離が困難である、複合体をつくるものはホモダイマーしか単離出来ない等の問題点があるとされている。そこで、酵母の細胞内でよりin vivoに近い状態でDNA-蛋白相互作用を検出できるone-hybrid法を改変した方法を用いた。HSP81プロモーター/GUS融合遺伝子を多コピー系プラスミドYEplac181につなぎ、S.cerevisiae RAY3A株に導入、各コンストラクトの常温での活性を接合型ごとに測定した(表1)。全ての接合型で81-1が最も活性が高く81-2,81-3はそれよりも1桁以上低い活性しか示さなかった。これらの結果は植物の中での傾向と異なり、HSEの保存性と活性が並行関係にある(図6)。これはヘテロの系でのアーティファクトの可能性もあるが、HSE以外の因子がHSP81-2,3遺伝子の発現制御に必要である可能性を示唆していると考えた。

　さらに各コンストラクト毎に熱処理に対する反応性を検討した。その結果81-2が40℃の熱処理で25℃の約170倍の活性を示し顕著な誘導を受けた。これに対し81-1ではその活性は25℃のときが最も高く、熱ショック処理温度を上げるに従って活性の低下がみられ、81-3では誘導温度による有為な活性の差は認められなかった(図7)。

　ここまでの結果を踏まえた上で、常温での構成的な活性が相対的に低く、誘導の余地があることから上流の発現制御因子の単離にはHSP81-2プロモータを用いることとした。

　シロイヌナズナcDNAライブラリは低コピーで維持されるCEN4系プラスミドpSE936のATGを含まないGAL1プロモータの下流にcDNAが挿入されている(ロナルド・デイビス博士より分与)。

　約20万コロニーをGUS活性を指標にスクリーニングした結果、ガラクトースの誘導により約2〜4倍の活性を示す候補が8クローンを単離した。これらの中より相対的に活性の高いものを選びcDNAを回収、部分的に塩基配列を決定したところ#102,#108がNewmanらが大量単離を行ったシロイヌナズナzinc finger DNAsに含まれるクローンと#105がレセプター型キナーゼと高い相同性を持つことが判明した。転写産物の蓄積傾向をノーザン解析により解析したところ#102,#105がロゼット葉特異的に、#108がスクリーニングに用いたHSP81-2と地上部に関しては同様の傾向で蓄積が認められた(図8)。熱ショックによる誘導性,HSP81-2で認められた10M IAA.0.1M NaClによる誘導は有意なものは認められなかった。これらがシロイヌナズナ核ゲノムに由来するものであることを確認するため緩やかな条件でサザン解析を行った。3分子とも核コードのシロイヌナズナ遺伝子であることを支持する結果が得られたが、#102,#105はそれ自身以外に3本以上のシグナルが認められ遺伝子群を形成していることが予想される。

　#102,#108が転写因子である可能性が高いと考えられたため、これらについて更にcDNAライブラリをスクリーニングし、得られた最長のcDNAの塩基配列を決定した。#102は転写因子であることを強く支持するモチーフ配列は持っていなかったがHMG box結合因子であるubf-1で保存されている領域と高い相同性を示す領域を持っていた。

　#108は明確な核移行シグナルを持っており核蛋白であることが予想された(図9)。またC末端近くにtyrosine kinaseの活性部位と相同性の高い領域を持っていた。既知のDNA結合モチーフは見つけることができなかったが、モチーフ以外の領域ではhunchbackを始めとする転写因子と高い相同性を持つ領域を含んでおり、核において何らかの転写-調節に関与していることが予想される。

　さらに検索の範囲を拡げるため、レポーターとしてHIS3遺伝子を用いたものを作成した。ヒスチジン合成阻害剤である20mM3AT存在下で約15万コロニーをスクリーニングし、最終的に5クローンを単離した。これらよりcDNAを回収し部分的に塩基配列を決定したところ、#H90が熱ショック因子(HSF)と高い相同性を保持していた。シロイヌナズナにおいてはトマトのHSFをプローブにHubelらによりAthsf1が単離されているがこれとは塩基配列が異なっていた。これがシロイヌナズナ核ゲノムに由来するものであることを確認するため緩やかな条件でサザン解析を行ったところ核コードのシロイヌナズナ遺伝子であることを支持する結果が得られた。トマトの3分子種を始めとしてHSF遺伝子は複数存在するのが一般的であり、新たなHSFを単離したと考えている。転写産物の蓄積を見るためノーザン解析を行ったところ、常温、熱ショック処埋植物とも転写量は極めて少なく一般的な条件では検出できなかった。

　ここで得られたクローンがHSP81-2プロモータDNAと相互作用することを確認するため、これらcDNAを持つ酵母をガラクトース存在下で16時間生育させたものから粗蛋白画分を抽出し、HSP81-2プロモータDNAを制限酵素処理で断片化したものをプローブにゲルシフト解析を行った。高イオン濃度、低イオン濃度の両方でアッセイしたところ、メジャーなバンドのシフトでcDNA特異的なものは認められなかったが、低分子側で#H90特異的にシフトするバンドが複数認められた(図10)。