APCはヒト血漿の凝固時間を濃度依存的に延長させた。血小板をトロンビンで処理し膜上に発現させたFVaや精製FVIIIaを用い構築した凝固反応系で、APCが両因子を不活化し抗凝固作用を発揮することを確認した。APCの作用発現にはリン脂質の存在が必要で、ProteinS(PS)が補酵素として働き、作用が増強された。またフォンビルブランド因子と複合体を形成し、活性化されていないFVIIIに対しては作用を示さなかった。さらに、線溶系に対する作用を検討した結果、APCがtype-1 plasminogen activator inhibitor(PAI-1)活性を直接阻害し、線溶を亢進することを見い出した。以上の結果から、APCは血管内皮細胞や血小板など血栓が形成されている固相上で、活性化した凝固因子を選択的に不活化し抗凝固作用を発揮し、また線溶亢進作用を併せ持ち、凝固・線溶の両面から抗血栓作用を発揮する特性を持つことが示唆された(図1.)。

図1.APCの凝固・線溶系に対する作用点

　APCの研究の過程で、動物種間で抗凝固作用発現の感受性が異なり、特にラット血漿で高濃度のAPCが必要であることを見出した。そして種差の原因を解明することがAPCの抗凝固作用機序を精査する上で重要と考えた。APCはPSを補酵素としてFVa、FVIIIaを分解し抗凝固作用を発揮する。またAPC自体も血中のPC Inhibitors(PCIs)で不活化される。これらの因子が種差に関与すると考えられるので、ラット及びヒトの各因子とAPCの反応性を比較した。まず、PS、V、VIIIそれぞれの欠乏ヒト血漿に少量のヒト或いはラット血漿を各因子源として加え、APCの凝固時間延長作用を比較した。その結果、FVIIIに種差は見られなかったが、ラット血漿をPS或いはFVとして用いた系でAPCの抗凝固作用が発現されにくい結果が得られ、ラットの両因子がAPCと反応しにくい可能性が示唆された。まずPSの種差を精査するため、ヒトPSを精製しラット血漿に加えた結果、APCの凝固時間延長作用が増強されたが、その程度は軽度であった。更にFVの種差を精査するためラットFVを精製しヒトFVと比較した。その結果、ラットFVaを不活化するために、ヒトFVaを不活化する30倍の濃度のAPCが必要であった。またラットFVaの不活化はヒトPSを添加しても殆ど増強されなかった(図2.)。なおヒト及びラットのPCIsによるAPC不活化速度に関し種差は小さかった。以上の結果から、ラットPSがAPCの補酵素としての作用が弱く、またラットFVaがAPCにより不活化されにくいことが種差の原因になっており、特に後者の関与が大きいことを初めて明らかにした。動物種差の検討を通じ、APCの抗凝固作用発現にFVaの不活化が重要である可能性を明らかにした。

図2.APCによるヒトおよびラットFVaの不活化作用の種差

　in vitroで明らかにしたAPCの薬理特性がDIC治療においてどのように発揮されるか、組織トロンボプラスチンで惹起したウサギDICモデルを用い代表的な抗凝固薬であるヘパリン(Hep)と比較した。静脈内持続投与したAPC及びHepは凝固活性化に伴う血小板数やフィブリノーゲンの減少を同程度に抑制した。しかしHepがDIC惹起により延長した耳介静脈からの出血時間を更に延長させたのに比べ、APCは出血時間を正常に戻した。この違いは、APCは固相上で抗凝固作用を発揮する特性を持つが、ヘパリンは固相、液相で選択性なく作用することに基づくものと考えられる。またAPC投与動物ではHep投与動物に比ベフィブリン分解産物の血中濃度が高く、また腎糸球体へのフィブリン沈着も見られなかった。APC投与動物で血中PAI-1活性が有意に低下しており、APCが線溶を亢進させる結果、血栓溶解に働いたと考えられる(表1.)。以上の結果より、外因性に投与したAPCがDIC治療効果を発揮することを初めて明らかにした。DICモデルにおいてもin vitroで明らかにした薬理特性が発揮され、薬効、安全性の両面からDIC治療薬として有用性が高いことを実証した。

表1.ウサギDIC惹起6時間後の凝固、線溶系パラメーター、出血時間に対するAPC、ヘパリンの作用

　DIC、特に敗血症など細菌感染に伴うDICでしばしば臓器障害を併発し、患者の生存、予後に影響する。DIC治療薬の開発においても臓器障害発症に留意することが重要と考える。ラットに組織トロンボプラスチン(TP)或いはエンドトキシン(LPS)を投与し惹起した2種のDICモデルで臓器障害発症に違いがあるか分析した。まずDICの指標である血小板数やフィブリノーゲン、FDPの変化を指標に、凝固線溶系を同程度に活性化する両惹起物質の投与量、投与法を設定した。そして臓器障害の発症を比較した結果、LPS惹起DICでTP惹起DICに比べ重篤な臓器障害が発症した。血栓が形成されるだけでは臓器障害を発症しないことが示された。特に肝障害を反映するGOT、GPTがLPS惹起DICにおいて上昇した。そこで肝臓の一部を切除したラットにLPSを投与し劇症肝炎を発症させAPCの作用を検討した結果、APC投与によりGPTの上昇が抑制され、肝障害発症を抑制することを明らかにした。細菌感染に伴い上昇するPAI-1活性が臓器障害の程度と相関することが報告されており、APCがPAI-1活性阻害に基づき臓器障害発症を抑制すると考えられた。

　DICモデルにおける評価で、APCが出血を助長しない特性を持つことを実証した。APCは血栓が形成されている血管内皮細胞や血小板上で抗血栓作用を発揮し、血管構造が破綻した出血部位では作用しないと考えられる。また止血の初期には血小板粘着により開始される一次止血機構が作働する。そこでAPC、およびHepをウサギに投与した時の一次止血に対する作用を出血症状と併せ比較検討した。

　血液凝固時間の延長を指標に、同程度に抗凝固作用を発揮するAPC或いはHepをウサギに静脈内持続投与し、耳介静脈からの出血時間を比較したところ、APCに比べHepを投与した動物で顕著な出血時間の延長が見られた。同時に採血した血液を用い、一次止血に対する作用をThrombostat4000を用い検討した。本装置はコラーゲンを塗布したアセテート膜に150mの小孔を開け、そこに一定圧で血液を通し、血小板粘着により孔が狭窄し減少する流速の変化を測定することで一次止血をモニターする装置である。APCは流速の変化に影響しなかったが、Hepを投与した動物の血液では小孔が塞がれるまでに流れた血液量が有意に増加し、この変化は出血時間の延長と相関した。さらに血小板凝集計を用い、APCは血小板粘着に影響せず、Hepがコラーゲン線維への血小板粘着を抑制することを示した。Hepの血小板粘着阻害が出血増強の一因であり、APCはこれに作用しないことが出血を促進しない機序の一つと考えられた。

　ヒト血漿より高純度に抽出、調整したヒト活性化プロテインC製剤(APC)の薬理特性、さらにDIC治療薬としての有用性を検討し以下の結果を得た。

　1)APCはPSを補酵素としてFVa、FVIIIaを不活化し抗凝固作用を発揮した。作用発現にはリン脂質が必要で、また活性化されたFVIIIaを選択的に不活化した。更にAPCがPAI-1活性を直接阻害し線溶亢進作用を発揮することを見出した。APCが血管内皮細胞や血小板など血栓が形成される固相上で、活性化した凝固因子を選択的に不活化すること、また線溶亢進作用を併せ持ち、凝固・線溶の両面から抗血栓的に作用する特性を持つことを明らかにした。

　2)APCの抗凝固作用発現には動物種差があり、ラット血漿において抗凝固作用を発揮するのに高濃度を必要とした。種差発現の原因を検討した結果、ラットのFVaがAPCで不活化されにくいことが主な原因であることを発見し、APCの抗凝固作用発現にFVaの不活化が重要である可能性を明らかにした。

　3)ウサギDICモデルを用いAPCの薬効を検討し、APCが出血を増強することなく抗凝固作用を発揮すること、また線溶亢進作用を発揮し血栓の保持を強く抑制することを明らかにした。1)で示した薬理特性が病態モデルでも発揮されることを実証した。またDICでは重篤な臓器障害を併発する場合があるが、APCはLPS投与下で作製した劇症肝炎の発症を抑制した。

　4)APC、ヘパリンの一次止血に対する作用を比較し、ヘパリンが血小板粘着を抑制し一次止血反応を阻害する結果、出血時間を延長させることを明らかにした。APCは一次止血に対し作用しなかった。APCが血栓形成固相上で抗血栓作用を示すことに加え、一次止血に作用しないことが出血を促進しない要因であると考えられた。

　以上のように、APCの凝固・線溶系に対する薬理特性を明らかにすると伴に、外因性に投与したAPCがDIC動物モデルにおいても薬理特性を発揮し、有用性の高い治療薬になる可能性を初めて示唆することができた。DIC治療に新しい概念を加えることができたと考える。以上の成果を基に、現在、本剤のDIC治療に対する臨床試験を進めている。