ラットおよびウサギ大動脈の高濃度K⁺液あるいはノルエピネフリンによる持続性収縮に対し、フォルスコリンおよびdb-cAMPは濃度依存的な抑制作用を示した。いずれの場合においても、ノルエピネフリン収縮は高濃度K⁺収縮よりも強く抑制され、またノルエピネフリンおよびK⁺の濃度を増加することによりフォルスコリンおよびdb-cAMPの抑制作用は減弱した。

　ウサギ大動脈を高濃度K⁺液とベラパミルで処理した「脱分極筋」におけるノルエピネフリン収縮に対し、フォルスコリンおよびdb-cAMPは通常の分極筋におけるノルエピネフリン収縮とほぼ同様の抑制作用を示した。従って、フォルスコリンおよびdb-cAMPの収縮抑制作用は、膜の過分極によるものではないと考えられた。

　cAMP増加作用の無いフォルスコリンの誘導体である1,9-ジデオキシフォルスコリンは、高濃度K⁺収縮に対し、フォルスコリンより弱い抑制作用を示し、またノルエピネフリン収縮はほとんど抑制しなかった。

　フォルスコリンは、濃度および時間依存的にcAMP量を増加させた。ウサギ大動脈において、ノルエピネフリンあるいは高濃度K⁺液はcAMP量を変化させず、またフォルスコリンによるcAMP量の増加に対しても影響がなかった。従って、フォルスコリンの収縮抑制作用はcAMPを介するが、ノルエピネフリン収縮と高濃度K⁺収縮に対する抑制作用の相違は、cAMP増加作用の変化によるものではないと考えられた。

　cAMPはホスホジエステラーゼ(PDE)により不活性な5’-AMPに代謝される。PDE阻害薬であるイソブチルメチルキサンチンとアムリノンは、いずれもフォルスコリンあるいはdb-cAMPによる収縮抑制作用を増強した。従ってフォルスコリンとdb-cAMPは、細胞内cAMP量に依存する機序により収縮抑制作用を示すものと考えられた。

　高濃度K⁺液による持続性収縮は電位依存性Ca²⁺チャネル(VDC)を介した細胞外からのCa²⁺の流入により生じ、ノルエピネフリンなどの受容体に作用する収縮薬による持続性収縮においては、これに加えてVDCとは異なるイオンチャネル(おそらくは非選択的陽イオンチャネル)を介したCa²⁺の流入も起こる。この様なCa²⁺流入経路は、⁴⁵Ca²⁺を用いた取り込み実験により明らかにされている。ラットあるいはウサギ大動脈においてフォルスコリンまたはdb-cAMPは、このノルエピネフリンによるCa²⁺流入量の増加を抑制したが、フォルスコリンは高濃度K⁺によるCa²⁺流入量の増加を抑制しなかった。従って、ノルエピネフリン収縮に対するフォルスコリンおよびdb-cAMPの抑制作用の少なくとも一部は、ノルエピネフリンによるCa²⁺流入の阻害によるものと考えられた。

　ラット大動脈に蛍光Ca²⁺指示薬であるfura-2を取り込ませ、平滑筋細胞内の遊離Ca²⁺濃度を測定した。高濃度K⁺あるいはノルエピネフリンの累積的投与により、収縮張力と細胞内Ca²⁺濃度の濃度依存的な増加が観られ、フォルスコリンおよびdb-cAMPは、これらの収縮とCa²⁺濃度の増加をいずれも抑制した。低濃度のフォルスコリンおよびdb-cAMPは、収縮とCa²⁺濃度をほぼ同程度に抑制したが、これに対し、高濃度のフォルスコリンおよびdb-cAMPはCa²⁺濃度よりも収縮張力をより強く抑制した。このことから、フォルスリンおよびdb-cAMPは血管平滑筋の収縮時におけるCa²⁺濃度の増加を抑制し、さらに高濃度の適用によって収縮蛋白系のCa²⁺感受性を低下させる作用を持つことが示された。

　ラット大動脈において、ノルエピネフリン収縮は、有機Ca²⁺拮抗薬によりCa²⁺濃度を低下させても収縮が残存した。これはノルエピネフリンによりある種のシグナル伝達系、たとえばC-キナーゼが活性化され、収縮蛋白系のCa²⁺感受性が上がったか、またはCa²⁺非依存性の収縮が起こったためと考えられる。この様な収縮に対し、フォルスコリンおよびdb-cAMPは対照のノルエピネフリン収縮に対するよりも強い抑制作用を示した。C-キナーゼ活性化薬のホルボールエステルのひとつである12-deoxyphrbol,13-butyrate(DPB)は、上記のノルエピネフリン収縮と同様の収縮作用を示した。フォルスコリンおよびdb-cAMPはこのDPB収縮を抑制し、またこの抑制作用はCa²⁺拮抗薬処置により増強された。

　これらのことから、フォルスコリンおよびdb-cAMPは、細胞内Ca²⁺濃度の減少に加え、C-キナーゼの活性化によるCa²⁺感受性の上昇による収縮に対しても、抑制作用を持つことが示された。しかも、この様な作用はフォルスコリンおよびdb-cAMPの比較的低濃度においてもみられることが明らかとなった。

　cAMPはcAMP依存性プロテインキナーゼ(A-キナーゼ)を活性化することが知られている。A-キナーゼは何らかの蛋白質をリン酸化し、リン酸化された蛋白はホスファターゼにより脱リン酸化されると想像される。またホスファターゼ抑制薬であるオカダ酸は平滑筋に対して収縮抑制作用があり、この作用にもある種の蛋白質のリン酸化が関与するものと考えられる。

　ラット大動脈の高濃度K⁺収縮において、フォルスコリンおよびdb-cAMPはオカダ酸の収縮抑制作用を強く増強したが、ニトロプルシッド、ニトログリセリン、心房性利尿ペプチド、ベラパミルおよびニカルジピンはいずれも増強作用が弱かった。従って、フォルスコリンとdb-cAMPの収縮抑制作用には、おそらくは特異的なA-キナーゼの活性化による蛋白質リン酸化の関与が強く示唆された。

　Ca²⁺除去液中では、ノルエピネフリンによる一過性の細胞内Ca²⁺濃度の上昇と一過性の収縮がみられる。フォルスコリンおよびdb-cAMPは、このCa²⁺濃度の上昇と収縮をともに抑制した。このときの収縮抑制作用は、Ca²⁺濃度上昇に対する抑制作用よりも強かった。またノルエピネフリンによる細胞内高親和性結合⁴⁵Ca²⁺の遊離は、フォルスコリン処置により抑制された。従って、フォルスコリンおよびdb-cAMPは、細胞内貯蔵部位からのCa²⁺遊離を抑制し、さらに収縮蛋白系のCa²⁺感受性を性下させることにより、ノルエピネフリンによる一過性収縮を抑制する作用を持つことが示唆された。

　以上を要するに、ラットおよびウサギ大動脈に対するフォルスコリンおよびdb-cAMPの収縮抑制作用とそれにともなう細胞内Ca²⁺動態の変化を検討した結果、血管平滑筋収縮のcAMPによる抑制は、(1)細胞内へのCa²⁺流入および(2)貯蔵部位からのCa²⁺放出を抑え、さらに(3)収縮蛋白系のCa²⁺感受性を低下させる機序によることが明らかとなった。

　ラットおよびウサギ大動脈の高濃度K液あるいはノルエピネフリン(NE)による持続性収縮に対し、FKおよびdb-cAMPは高濃度K収縮よりもNE収縮を強く抑制した。

　ウサギ大動脈を高濃度K液とべラパミルで処理した脱分極筋におけるNE収縮に対し、FKおよびdb-cAMPは通常の分極筋におけるNE収縮とほぼ同様の抑制作用を示した。従って、FKおよびdb-cAMPの収縮抑制作用は、膜の過分極によるものではないと考えられた。

　FKは、濃度および時間依存的にcAMP量を増加させた。ウサギ大動脈において、NEあるいは高濃度K液はcAMP量を変化させず、またFKによるcAMP量の増加に対しても影響がなかった。従って、FKの収縮抑制作用はcAMPを介するが、NE収縮と高濃度K収縮に対する抑制作用の相違は、cAMP増加作用の変化によるものではないと考えられた。

　PDE阻害薬であるインブチルメチルキサンチンとアムリノンは、いずれもFKあるいはdb-cAMPによる収縮抑制作用を増強した。従ってFKとdb-cAMPは、細胞内cAMP量に依存する機序により収縮抑制作用を示すものと考えられた。

　ラットあるいはウサギ大動脈において、高濃度KあるいはNEは収縮張力と細胞内へのCa流入およびCa濃度を増加した。FKまたはdb-cAMPは、NEによるCa流入量の増加を抑制したが、FKは高濃度KによるCa流入量の増加を抑制しなかった。従って、NE収縮に対するFKおよびdb-cAMPの抑制作用の少なくとも一部は、NEによるCa流入の阻害によるものと考えられた。低濃度のFKおよびdb-cAMPは収縮とCa濃度の増加をほぼ同程度に抑制したが、高濃度のFKおよびdb-cAMPはCa濃度よりも収縮張力をより強く抑制した。このことから、フォルスコリンおよびdb-cAMPは収縮時におけるCa濃度の増加を抑制し、さらに高濃度の適用によって収縮蛋白系のCa感受性を低下させる作用を持つことが示された。

　ラット大動脈において、NEあるいはホルボールエステルのひとつてある12-deoxyphrbol13-isobutyrate(DPB)は有機Ca拮抗薬存在下において細鉋内Ca濃度の上昇を伴わない持続性収縮を発生させるが、FKおよびdb-cAMPはこれらの収縮を抑制した。これらのことから、FKおよびdb-cAMPは、細胞内Ca濃度の減少に加え、C-キナーゼの活性化によるCa感受性の上昇による収縮に対しても抑制作用を持つことが示された。

　ラット大動脈においてFKおよびdb-cAMPはホスファターゼ抑制薬であるオカダ酸の高濃度K収縮抑制作用を増強したが、ニトロプルシド、ニトログリセリン、心房性利尿ペプチド、ベラバミルおよびニカルジピンはいずれも増強作用が弱かった。従って、cAMPの収縮抑制作用にはA-キナーゼの活性化による蛋白質リン酸化が関与していることが示唆された。

　Ca除去液中では、NEによる一過性の細胞内Ca濃度の上昇と一過性の収縮がみられる。FKおよびdb-cAMPは、これらをともに抑制した。またNEによる細胞内結合Caの遊離は、FK処置により抑制された。従って、FKおよびdb-cAMPは、細胞内貯蔵部位からのCa遊離を抑制し、NEによる一過性収縮を抑制する作用を持つことが示唆された。

　以上を要するに、血管平滑筋収縮のcAMPによる抑制は、(1)細胞内へのCa流入および(2)貯蔵部位からのCa放出を抑え、さらに(3)収縮蛋白系のCa感受性を低下させる機序によることが明らかとなった。これらの成績は学術上、応用上貢献するところが少なくなく、よって審査員一同は本論文が博士(獣医学)の学位論文として価値あるものとみとめた。