rIL-2は抗腫瘍薬として期待されているが体内からの消失が速く、かつ分布容積が大きく薬効発現のためには大量投与および頻回投与が必要であり、このため副作用の発現が問題となっている。本研究はrIL-2に特異的に結合するモノクローナル抗体を調製し、免疫複合体を創製しrIL-2の体内動態を改変することによりrIL-2の薬効増強を目的とした。スキャッチャード解析により抗体の解離定数K₄は2.1x10^-8M、結合部位数nは2.2Antigen/Antibodyであった。抗体/rIL-2のモル比を1/2で調製した免疫複合体の生物活性をIL-2感受性NKC3細胞の増殖効果で測定したところrIL-2単独と活性に差異は見られずこの抗rIL-2モノクローナル抗体はrIL-2を中和しないことが明らかになった。これらのことから免疫複合体は抗体1分子に2分子のrIL-2が結合し、そのエピトープはrIL-2のレセプター結合部位と異なることが推測された(図1)。

図1 免疫複合体の構造とrIL-2レセプターとの関係:抗体は2分子のrIL-2と結合し、その結合部位はIL-2レセプター結合とは異なるか、あるいは競合するために生物活性が保存されると推測される。

　免疫複合体をマウスに静脈内投与し、rIL-2の血中からの消失を調べたとろrIL-2単独投与と比較してモノクローナル抗体との複合体(IC-1)およびF(ab’)₂との複合体(IC-2)どちらも高濃度のrIL-2が検出された。ファルマコキネティカルな解析をしたところ分布容積に関してはrIL-2単独では600ml/kgに対してIC-1で70ml/kg、IC-2では120ml/kgと減少した。全身クリアランスはrIL-2単独で1320ml/h/kgに対して複合体はIC-1では132ml/h/kg、IC-2では287ml/h/kgと減少した。複合体の分子量に依存して分布容積および全身クリアランスが減少した。また、皮下投与後の血中濃度時間推移を調べたところrIL-2単独では30分でC_maxが得られその後、急速に血中濃度が減少するのに対して、免疫複合体は1時間でC_maxが得られ3時間までほぼ一定の濃度を維持した後、緩やかに減少した。ファルマコキネティカルな解析の結果AUCはほとんど変化ないがMRTが3倍延長し、かつMATが4倍延長し吸収過程の遅延効果が免疫複合体で見られた。

　免疫複合体のex vivo薬効をマウスに皮下連投した後、遊離脾細胞の腫瘍標的細胞への4時間⁵¹Crリリース活性で評価した。標的細胞としてNK活性はYAC-1を、LAK活性はP815を用いた。IC-1を10連投した後のNK活性はrIL-2単独と比較してIC-1はどの効果細胞/標的細胞(E/T)比においても高かった。また、LAK活性についてはrIL-2単独ではほとんど上昇しないがIC-2では徐々に上昇し10連投でコントロールと比較して3倍まで上昇した。このように免疫複合体により免疫系の殺細胞活性がrIL-2単独と比較して強く活性化されることが明らかになった。血中持続化およびリンパへの集積性に起因するものと推測される。

　免疫複合体の抗腫瘍効果を移植Meth-A fibrosarcomaに対する増殖抑制で評価した。腫瘍細胞移植後7日目から薬液を皮下反復投与し、腫瘍の大きさを経日的に測定したところrIL-2単独と比較して著しい増殖抑制効果をIC-1は与えた(図2)。

図2 Meth-A Fibrosarcoma移植マウスにおける免疫複合体1Qug/anirnsl/day皮下連投による腫瘍増殖抑制効果の低処置群およびrIL-2単独溶液投与群との比較

　12連投した後3日目に腫瘍重量を測定し未処置腫瘍の%で表したT/Cで効果を評価するとIC-1およびIC-2両免疫複合体も投与量に依存して抗腫瘍効果が得られた。

　モノクローナル抗体を用いてrIL-2との免疫複合体を創製し、活性を保持したまま容易に高分子化しrIL-2の体内動態、特に分布を改変した。この結果rIL-2の抗腫瘍効果が増強した。この手法は他の多くの生理活性蛋白に応用可能でありモノクローナル抗体の新規なDDSデバイスとして考えられる。

　モノクローナル抗体を用いた抗癌剤のターゲティング療法において投与後の腫瘍内不均一分布がそのターゲティング療法の限界の原因の一つと考えられている。この不均一性の原因として抗原の不均一分布、血管新生、血管透過性の不均一性、壊死の進行度、間組織の浸透圧などが報告されているが、モノクローナル抗体の結合活性そのものが腫瘍内部への抗体の浸透を妨げているとする理論(バインディングサイトバリア理論)があり、その実証が望まれていた。つまり、静脈内投与後の腫瘍内抗体の分布を血中からの消失、血管壁からの透過、腫瘍内拡散、抗原抗体反応に階層化し、それぞれ数式化したのち、境界条件で連結し各パラメータを変動させシュミレーションしたところ抗原抗体反応が抗体の腫瘍内分布を決定する重要なファクターであることを予測している。これを実証したのが本研究である。

　モルモットの腫瘍であるL10カルシノーマ細胞を背部皮内に移植し、移植後7日目に抗L10モノクローナル抗体(D3)を静脈内投与し経時的に腫瘍を摘出した後、腫瘍の薄連続切片を調製し抗体の腫瘍内ミクロな分布を放射性アイソトープおよび組織免疫法で解析した。まず、L10腫瘍細胞表面に存在する抗原数とD3モノクローナル抗体のその抗原に対する結合定数を遊離腫瘍細胞を用いた結合実験により結合定数Kaは1.6x10¹⁰M^-1、抗原数B₀は3.55x10⁵molecules/cellであった。この数値を用いて先ほどの数式により抗体の腫瘍内分布をシュミレーションルしたところ、低投与量投与の時は時間が経てもモノクローナル抗体は腫瘍中心部には浸透しないが、投与量を高投与量にすると時間とともに中心部まで浸透することが予測された。実際、腫瘍の抗原分布と抗体分布を組織免疫で確認したところ、低投与量ではモノクローナル抗体が抗原の周辺にしか分布しなかった.また,高投与量では抗原と抗体の分布が一致した。

　静脈内投与後のモノクローナル抗体はその結合活性そのものにより腫瘍内部に浸透できず、不均一な分布をすることを実証した。モノクローナル抗体を腫瘍標的化のデバイスとして応用するときその結合定数および抗原数について十分考慮する必要がある。