【目的】

現在臨床使用されているプロスタグランジン(PG)系眼圧下降薬は、すべてPGF2α誘導体であり、FP受容体を介した眼圧下降が主な作用機序と考えられている1が、動物実験に於いてはPGD2 2、PGE2 3による眼圧下降等、FP以外のプロスタノイド受容体刺激による眼圧下降も示唆されている。当研究では特にPGE2に注目し、その受容体の眼圧への関与を検討することで、新たな眼圧下降薬開発の基礎となる知見を得ることを目的とした。

【対象と方法】

FPないしEP1-3各受容体の単一遺伝子ホモ欠損(FPKO, EP1KO, EP2KO, EP3KO)マウス、およびバックグラウンドにあたる近交系のC57BL/6(WT)マウスを対象とした。(1)PGE2 methyl ester (ME)点眼液のWTマウス眼圧に対する影響、(2)EP1KO, EP2KO, EP3KOマウスの日中及び夜間眼圧、(3)FPKO, EP1KO, EP2KOおよびEP3KOマウスに対するPGE2 ME点眼液の眼圧下降効果、(4)特異的EP受容体サブタイプ刺激薬ONO-DI-004 (EP1 agonist), ONO-AE1-259-01 (EP2 agonist), ONO-AE-248 (EP3 agonist), ONO-AE1-329 (EP4 agonist)のマウス眼圧に対する影響、(5)ONO-AE1-259-01 (EP2 agonist), ONO-AE1-329 (EP4 agonist)の眼圧依存性房水流出率(C値)への影響を検討した。(1)-(4)に関しては圧トランスデューサーによって眼球内圧を直接精密に測定するマイクロニードル法4によって測定し、眼圧変化量(ΔIOP)=処置眼眼圧-対照眼眼圧、眼圧変化率=ΔIOP/対照眼眼圧×100(%)として評価した。(5)に関してはtwo-level constant pressure perfusion method 5によって測定した。全ての眼圧、眼圧変化率、房水流出率データは平均(mean)±標準誤差(SEM)で表記した。各統計手法において危険率5%未満を有意差ありとした。

【結果】

(1)0.1% PGE2 ME点眼による眼圧変化率は、1時間後で22.9 ± 4.5 (P=0.0051)と眼圧上昇を来し、2時間後で-25.5 ± 3.0 (P=0.0051)、3時間後で-26.3 ± 2.0 (P=0.0051)、6時間後で-18.3 ± 1.5 % (P=0.0050)と有意な眼圧下降を示した。点眼後3時間後に最大の眼圧下降効果が見られた。(Figure 1)

0.1% PGE2 MEが最大の眼圧下降効果を示した点眼3時間後において他の濃度のPGE2 MEが示した眼圧変化率は、0.01%で-15.7 ± 2.4 (P=0.0117)、0.001%で -6.1 ± 3.4 (P=0.1614) 、0.0001%で-0.4 ± 2.3 % (P>0.90)であり、0.1%および0.01%のPGE2 MEで有意な眼圧下降が見られた。各濃度間の眼圧変化率の比較では0.1%と他の濃度および0.01%とより薄い濃度との間に有意差が見られ(P<0.05)、濃度依存的に眼圧下降を来す傾向が見られた。(Figure 2)

(2)EP1KO、EP2KO、EP3KOおよびWTマウスの平均眼圧は日中(9:00)においてそれぞれ14.4±0.2mmHg、14.7±0.2 mmHg、14.5±0.2mmHgおよび14.3±0.3mmHg、夜間(21:00)においてそれぞれ19.3±0.4、19.6±0.2 mmHg、19.5±0.4mmHgおよび19.3±0.3 mmHgであった。各遺伝子型のマウスにおいて夜間眼圧は日中眼圧よりも高かったが、日中・夜間ともにマウス遺伝子型での眼圧の差は見られなかった(Table 1)。

(3)FPKO、EP1KO、EP2KO、EP3KOおよびWTマウスの0.01%PGE2 ME投与3時間後の眼圧変化率はそれぞれ-16.7 ± 3.6% (p=0.0117), -17.6 ± 2.5% (p=0.0077), -18.3 ± 1.4% (p=0.0117), -18.0 ± 3.6% (p=0.0116)および-16.9 ± 2.4% (p=0.0117)であった。眼圧変化率に関して、各遺伝子型のマウス間での有意差は認められなかった(Figure 3)

(4)0.1%の各受容体刺激薬(EP1 agonist, EP2 agonist, EP3 agonist, EP4 agonist)投与2時間後の眼圧変化率はそれぞれ、-0.5 ± 1.6 (P=0.6121), -21.1 ± 4.8 (P=0.0173), -0.1 ± 3.6 (P=0.8886) and -17.5 ± 2.9 % (P=0.0117)となり、EP2 agonistおよびEP4 agonistで有意な眼圧下降効果が見られたが、EP1 agonistおよびEP3 agonistでは見られなかった。(Figure 4)

0.1% EP2 agonist点眼による眼圧変化率はそれぞれ、1時間後で-2.1 ± 1.8 (p=0.2626)、2時間後で-21.1 ± 4.8 (p=0.0173)、3時間後で-16.4 ± 2.6 (p=0.0077)、6時間後で-6.4 ± 4.6 % (p=0.1282) (薬剤投与眼 対 溶媒投与眼、Wilcoxon signed rank test)であった。0.1% EP4 agonist点眼による眼圧変化率はそれぞれ、1時間後で-17.2 ± 1.8 (p=0.0117)、2時間後で-17.5 ± 2.9 (p=0.0117)、3時間後で-15.9 ± 1.8 (p=0.0117)、6時間後で-6.0 ± 1.7 % (p=0.0173)であった。EP2 agonistおよびEP4 agonistともに、点眼2時間後に最大の眼圧下降効果を示した。 (Figure 5)

0.1%のEP2 agonistおよびEP4 agonistが最大の眼圧下降効果を示した点眼2時間後において他の濃度の各agonistが示す眼圧変化率を測定した。EP2 agonistが示した眼圧変化率は、0.01%で-8.2 ± 4.4 (P=0.1235)、0.001%で -5.1 ± 3.4 (P=0.2626)、0.0001%で-3.3 ± 3.2 % (P=0.4838)であり、EP4 agonistが示した眼圧変化率は、0.01%で-6.7 ± 1.6 (P=0.0173)、0.001%で -3.1 ± 1.2 (P=0.0357)、0.0001%で-2.1 ± 0.8 % (P=0.0117)であった。各濃度間の眼圧変化率の比較ではEP2 agonist、EP4 agonistともに0.1%による眼圧変化率が他の濃度による眼圧変化率より有意に大きかった (Figure 6)。

FPKO、EP1KO、EP2KOおよびEP3KOマウスに0.1%のEP2 agonistおよびEP4 agonistを点眼し、WTマウスに対して最大の眼圧下降効果を示した点眼2時間後において眼圧を測定しWTマウスに対する投与結果と比較した。EP2 agonistがFPKO、EP1KO、EP2KO、EP3KO、WTマウスに示した眼圧変化率はそれぞれ、-17.4 ± 4.8 (P=0.0180)、 -17.9 ± 1.7 (P=0.0117)、0.1 ± 3.8 (P=0.8658)、-17.0 ± 4.3 (P=0.0173)、-21.1 ± 4.8 % (P=0.0117) であり、EP2KOマウス以外では有意な眼圧下降を示した。EP2 agonistがEP2KO以外の遺伝子欠損マウス群およびWTマウスに及ぼした眼圧変化率に、群間有意差は見られなかった (Figure 7)。EP4 agonistがFPKO、EP1KO、EP2KO、EP3KO、WTマウスに示した眼圧変化率はそれぞれ、-15.3 ± 4.3 (P=0.0077)、-14.6 ± 2.1 (P=0.0117)、-16.8 ± 2.7 (P=0.0180)、-10.2 ± 3.4 (P=0.0180)、-17.5 ± 2.9 % (P=0.0357)であり、EP4 agonistが遺伝子型の異なるマウス群に及ぼした眼圧変化率に、群間有意差は見られなかった(P>0.9、Kruskal Wallis test)(Figure 7)。

(5)WTマウスにおける0.005%latanoprost点眼2時間後の眼圧依存性房水流出率(C値)は0.0086±0.0002μL/min/mmHg、溶媒点眼2時間後のC値は0.0056±0.0005 μL/min/mmHgであり、latanoprost投与眼では有意に房水流出率の増大が見られた(P=0.0011) (Figure 8A)。0.1% EP2 agonist、0.1% EP4 agonistないし、その溶媒を点眼した2時間後のC値はそれぞれ0.0066±0.0003、0.0070±0.0010、0.0065±0.0003 μL/min/mmHgであり、両agonistともに溶媒のC値と有意差がなかった (P=0.539、Kruskal Wallis test) (Figure8B)。

【考察】

当研究では0.1%PGE2 ME点眼1時間後において一旦眼圧が上昇し、その後に下降した(Figure 1)。兎眼においてPGE2点眼後、前房内炎症を伴った一過性の眼圧上昇後に眼圧下降を来すことが報告されており6、当実験における眼圧上昇も前房内の炎症惹起によると考えられた。PGE2はFP, EP1, EP2, EP3, EP4, DPの各受容体に対して結合阻害定数 = 100, 20, 12, 1, 2 and 2.4 nMと幅広い親和性を持つことから、眼圧下降に関与する受容体サブタイプはこの結果のみでは特定されなかった。

続いてEP1KO, EP2KO, EP3KOマウスの眼圧測定を行った。EP4KOマウスに関しては、動脈管開存による新生児致死性の為検討を行わなかった。日中および夜間において各ノックアウト(KO)マウスの眼圧はWTマウスと差が無く(Table 1)、EP1-3受容体はマウス正常眼の眼圧恒常性に関与していないか、単一受容体のKOでは他の受容体が代償性に機能し、眼圧恒常性が維持されたと考えた。

更にKOマウスを用いて、PGE2の眼圧下降効果に関与する受容体を検討した。しかし0.01%PGE2 ME 投与3時間後の眼圧変化率に関しては、各KOマウス間に明らかな差は見られず(Figure 3)、PGE2の眼圧下降効果に関与する受容体サブタイプの同定は出来なかった。

従ってEP1-4の各受容体agonist点眼後の眼圧変化を検討することで、眼圧下降に関与するEP受容体サブタイプの検出を試みた。結果、EP2 agonistおよびEP4 agonistによって眼圧下降が見られたことで、EP2およびEP4受容体を介した眼圧下降作用が初めて示された(Figure 4)。眼内でのEP受容体の分布はマウスとヒトにおいて類似していることが報告されており7、眼内房水の流出や産生に関与する部位である虹彩の括約筋、線維柱帯、シュレム管、毛様体無色素上皮に於いてはEP2受容体が最も多く発現し、それに次いでEP4受容体の発現が見られ、EP1およびEP3受容体の発現は比較的少ないことが示されている。眼圧下降への関与が見られなかったEP3受容体は主に共役する3量体Gタンパク質がGiでありセカンドメッセンジャーであるcAMPの減少を来し、EP1は主にCa2+の増加を来す8が、眼圧下降への関与が見られたEP2受容体とEP4受容体は共にGsと共役してセカンドメッセンジャーであるcAMPの増加を来すことが知られている9。更に血管や毛様体平滑筋においてEP2 (10)およびEP4 (11)受容体刺激によるcAMP産生増大が平滑筋弛緩を来すことが示唆されており、毛様体平滑筋弛緩等による房水流出増大が、眼圧下降機序の一つとして考えられた。

次に、EP2 agonist及びEP4 agonistの眼圧下降機序を検討する為に、点眼後の房水流出率(C値)を測定した。また陽性コントロールとして、マウスにおけるFP受容体を介した眼圧下降とC値の増大が報告されている(12) 0.005% latanoprost点眼後のC値を測定した。当研究でもlatanoprostではC値の増大が見られ、EP2 agonist及びEP4 agonistでは見られなかった。房水流出路には経シュレム管路と経ブドウ膜強膜流出路があり、ブドウ膜強膜流出は眼圧依存性が低い(13)ことから、C値は主に経シュレム管路の房水流出率を示すと考えられる5。従ってEP2 agonist及びEP4 agonistの眼圧下降機序は、マウスにおいては既存のPG系眼圧下降薬であるlatanoprostと異なり、主に経ブドウ膜強膜流出路の抵抗減少ないしは房水産生抑制であることが推察された。

【結論】

本研究において著者らは、PGE2の眼圧に対する影響をマウスに対するものとしては初めて示した。更にEP受容体に特異的な刺激薬を用いることで、EP2受容体とEP4受容体がPGE2の眼圧下降作用に関与することを明らかにした。EP2受容体とEP4受容体を介した眼圧下降は、マウスにおいてはFP受容体を介した眼圧下降とは異なることを示し、経ブドウ膜強膜流出路の房水流出促進ないしは房水産生抑制機序によることを示唆した。

Fig. 1. Time course of 0.1% PGE2 ME-induced IOP reduction in WT mice

IOP was measured 1, 2, 3, and 6 hours after administration by a microneedle method. Data are expressed as mean ± SEM (n=10 for time point).

*: P<0.01 for treated vs. contralateral carrier treated eye (Wilcoxon signed-rank test).

Fig. 2. Dose dependent tendency of IOP reduction by PGE2 ME in WT mice. PGE2 ME of each dose was instilled at 18:00 and IOP was measured 3 hours later. Data are expressed as mean ± SEM (n=8 for each dose).

* : P<0.02 for treated vs. contralateral carrier treated eye (Wilcoxon signed rank test). , P<0.05 between the two doses (Steel test)

Table 1. Baseline IOP in EP1KO, EP2KO, EP3KO and WT mice.

Data are expressed as mean±SEM. Parenthetic numbers indicate numbers of animals. There was no significant difference in IOP among genotypes during the day and at night (P>0.05, Kruskal Wallis test).

Fig. 3. IOP lowering effect of 0.01%PGE2 ME in FPKO, EP1-3KO and WT mice.

IOP was measured at 3 hrs after administration. Data are expressed as mean ± SEM (n=8 for each genotype). In all genotypes 0.01%PGE2 ME showed statistically significant IOP reduction compared to the carrier (P<0.02, Wilcoxon signed rank test). There was no significant difference in IOP reduction between the four types of knockout mice and WT mice. (P=0.52, Kruskal Wallis test).

Fig. 4. IOP lowering effect of 0.1% ONO-DI-004 (EP1 agonist), ONO-AE1-259-01 (EP2 agonist), ONO-AE-248 (EP3 agonist) and ONO-AE1-329 (EP4 agonist).

Each drug was applied at 18:00 and IOP was measured at 2 hrs after the administration. Data are expressed as mean±SEM (n=8 for each agonist) *, P<0.02 for treated vs. contralateral carrier treated eye (Wilcoxon signed rank test).

Fig. 5. Time course of 0.1% ONO-AE1-259-01 (EP2 agonist) and ONO-AE1-329 (EP4 agonist) agonist-induced IOP reduction in WT mice.

Data are expressed as mean ± SEM (n=8). *, P<0.02 for treated vs. contralateral carrier treated eye (Wilcoxon signed rank test).

Fig.6. Dose-dependent IOP reduction by ONO-AE1-259-01 (EP2 agonist) and ONO-AE1-329 (EP4 agonist) in WT mice.

Data are expressed as mean ± SEM (n=8 for each dose). IOP was measured at 2 hrs after administration. *: P<0.05 for contralateral vehicle carrier eye (Wilcoxon signed rank test) #: P<0.05 against 0.01% or lower concentrations of each agonist (Steel test).

Fig.7. IOP reduction by 0.1% ONO-AE1-259-01 (EP2 agonist) and ONO-AE1-329 (EP4 agonist) in FPKO, EP1-3KO and WT mice.

IOP was measured at 2 hrs after administration. Data are expressed as mean ± SEM (n=8 for each genotype). *: P<0.05 for contralateral carrier treated eye (Wilcoxon signed rank test).

Fig.8. Effects of EP2 agonist, EP4 agonist and latanoprost on Outflow Facility.

C value indicates trabecular outflow facility.

A. C value by 0.005% latanoprost and its vehicle solution.

B. C value by 0.1% EP2 agonist, 0.1%EP4 agonist and its carrier solution. Data are expressed as mean ± SEM (n=8 for each solution). *, P<0.01 by Mann Whitney U-test.

本研究は、現在抗緑内障点眼薬の第一選択として使用されているプロスタグランジン(PG)F(2α)誘導体以外のPGによる眼圧下降を検討するために、マウス眼圧および房水動態に対するPGE2ないしEP受容体特異的刺激薬の影響を検討したものであり、下記の結果を得ている。

1.PGE2 methyl ester (PGE2ME)は点眼後、前房内炎症惹起によると思われる一過性眼圧上昇後に、マウスにおいても眼圧下降を来すことを示した。また既存の抗緑内障点眼薬(latanoprost)とは異なり、PGE2MEはFP受容体ノックアウトマウスにおいても眼圧下降作用を有することを示し、FP受容体を介さない眼圧下降を明示した。

2.EP受容体サブタイプの内、EP1, EP2, EP3の各単一EPノックアウトマウスは、昼夜の眼圧がバックグラウンドである野生型マウスの眼圧と差がないことを示し、マウス眼圧恒常性に複数の受容体が関与することを示唆した。

3.EP2刺激薬およびEP4刺激薬点眼後の眼圧下降を証明した。更にEP2ノックアウトマウスにおいて、EP2刺激薬の効果消失とEP4刺激薬の眼圧下降効果を示し、EP2とEP4が独立して眼圧下降に関与することを示した。

4.EP2刺激薬およびEP4刺激薬点眼後は、latanoprost点眼後とは異なり、主として圧依存性の、即ち経シュレム管路の房水流出が有意に変化しないことを示し、それ以外の機序(経ブドウ膜強膜路の房水流出ないしは房水産生抑制)による眼圧下降を示唆した。

以上、本論文において著者らは既に眼圧下降への関与が報告されているFP受容体以外のPG受容体であるEP2, EP4受容体の眼圧下降への関与を新たに示した。PGF2α以外のPGによる眼圧下降を示唆する報告は複数あるが、内因性のPGは複数の受容体に作用することから、関与する受容体を詳細に検討した報告は少ない。本研究では1から4まである各EP受容体の特異的刺激薬とEP1-3の各ノックアウトマウスを使用することで、眼圧下降に関与するEP受容体を特定した。眼内のEP受容体発現に関してはヒトとマウスの類似性が報告されている。これらの結果は、今後の緑内障治療薬開発の基礎となる重要な知見と考えられ、学位の授与に値するものと考えられる。