イノシトールリン脂質代謝は、ホスファチジルイノシトールキナーゼ(PI kinase)、ホスファチジルイノシトールポリリン酸ホスファターゼ(IPPase)、そしてホスホリパーゼC(PLC)の三種類の酵素によって制御されている(図1、図2)。1989年にPI 3-kinaseが見つかって以来、PI-3-kinaseおよびその産物であるホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸(PI3,4,5-P3)の機能を中心に、イノシトールリン脂質代謝研究が進められてきた。その結果、PI3,4,5-P3がプロテインキナーぜC(PKC)を活性化してアポトーシスを阻害することが分かるなど、細胞増殖、細胞骨格系の制御など多くの細胞機能にPI-3-kinaseが関与することは、有名なことである。加えて、この数年新規のPI 3-kinase,PI4P-5-kinase,PI5P-4-kinase、PLCなどが相次いで単離され、その活性化機構が明らかとなりつつある。さらに、ホスファチジルイノシトール-3-一リン酸がFYVEフィンガーモチーフを持つ蛋白に特異的に結合するなど、リン酸基の位置によってリン脂質自身が特異的な標的分子を持ち、特異的な機能を持つことが示されつつある。このように、イノシトールリン脂質代謝経路は、シグナル依存的にイノシトールリン脂質のリン酸化、脱リン酸化によって、多くの複雑な機能を巧みに制御する機構であり、その仕組みを解明することは大変に意義深い。

図表図1 イノシトールリン脂質代謝の概念図 / 図2 イノシトールリン脂質生成経路

　イノシトールポリリン酸ホスファターゼ(IPPase)は、イノシトールリン脂質の脱リン酸化酵素であり、脱リン酸化部位によって、D-1位を加水分解する1-ホスファターゼや、D-4位のリン酸基を脱リシ酸化する4-ホスファターゼなどに分類される。イノシトールポリリン酸5-ホスファターゼ(IP5Pase)は、イノシトールリン脂質やホスファチジルイノシトールのD-5位を脱リン酸化する酵素である。IP5Paseは,ホスホリパーゼC(PLC)の基質であるホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸(PtdIns4,5-P2)を脱リン酸化を介して、プロテインキナーゼC(PKC)の活性化因子であるジアシルグリセロール(DG)や、小胞体から細胞内へのカルシウム放出を促す機能を持つ、イノシトール1,4,5-三リン酸(Ins 1,4,5-P3)の量を負に調節する機能を持つ。

　これまで八種類のIP5Paseが単離されており、いずれも高度に保存された活性モチーフを持っており(図3)、基質特異性によって三種類に分類されている。Type I phosphataseは、分子量43kDaの蛋白で、Ins 1,4,5-P3および、イノシトール1,3,4,5-四リン酸 (Ins1,3,4,5-P4)のみを基質とすることから、細胞内カルシウム濃度の調節を行うと考えられている。Type III phosphataseであるSHIP(SH2 containing inositol phosphatase)はShcやBtkのSrc Homology3(SH3)ドメインと結合し、Fc受容体を介したB細胞の免疫抑制を制御する酵素である。SHIPはD-3位にリン酸基の付いている PtdIns 3,4,5-P3 およびIns1,3,4,5-P4のみを基質とすることから、PI-3-kinaseシグナルを負に制御すると考えられている。Type II phosphataseは、PtdIns 4,5-P2,PtdIns 3,4,5-P3,Ins 1,4,5-P3,Ins1,3,4,5-P4を基質とする酵素であり、複数の新規分子が最近同定されている。Synaptojaninは、N末端にIPPase活性を持つ酵母のSAC1蛋白に似たドメインを、C末端にはGrb2などのSH3ドメインと結合する、プロリンに富んだ配列を持つIP5Paseである。Synaptojanin 1は神経終末でのエンドサイトーシスの制御を行うこと、加えてプロフィリンなどのアクチン細胞骨格調節蛋白に結合するPtdIns 4,5-P2を分解し、アクチン線維を脱重合へ向かわせることも示されている。しかし、その詳しい制御機構は明らかとなっていない。.Pharbinは、最近見つかったType II IP5Paseで、膜に局在してデンドライト様の構造を誘導する機能を持つ。このように多くの分子が同定され、アクチン細胞骨格系を始め、多くの機能への関与が示唆されているものの、その生理的な意義はまだ不明な点が多い。今回、新たなIPPaseの機能を解析する目的で、新規IP5Paseの単離を行った。

図3 これまでに同定されたIP5Paseの構造

　GENBANKに登録されているIP5Pase活性モチーフを持つ、およそ400bPのcDNAクローンをプローブとして、様々なcDNAライブラリーをスクリーニングした結果、2種類の新規IP5Pase様のcDNAが得られた。一つは、ラット脳ライブラリーから得られた、全長3,322bp、1001アミノ酸からなる、分子量107kDaのIP5Paseであった。このIP5Paseは、N末端にプロリンに富んだ領域を持つことから、PIPP(Prorine enriched Inositol Phosphatase)と名づけられた。PIPPは多くの蛋白活性を制御する14-3-3蛋白と結合する配列を持ち、細胞のメンブレンラッフリングを起こしている部分に局在するType IIのIP5Paseであった。もう一つは、ヒト精巣由来のライブラリーから得られた、全長約2,800bp、446アミノ酸からなる、分子量51kDaのIP5Pase様の蛋白をコードしていた。この蛋白はIP5Pase活性モチーフ以外に特徴的な配列のない単純な構造であった。ノーザンブロッテイングの結果、全ての臓器で発現が認められたが、中でも骨格筋、腎臓、心臓に非常に高い発現が見られたことから、この蛋白をSKIP(Skeletal muscle and Kidney enriched Inositol Phosphatase)と名付けた。SKIPに対する特異的な抗体を作製し、組織および細胞由来の抽出液に対してウエスタンブロッテイングを行った結果、ラットの脳や神経芽細胞であるN1E-115細胞では、予想された51kDaの蛋白の発現が見られた。一方、繊維芽細胞であるNIH-3T3細胞やSWISS-3T3細胞、筋芽細胞であるC2C12細胞では、43kDa付近に特異的な発現が認められた。この分子量の違いはスプライシングアイソフォームによるものであった。SKIPはIns 1,4,5-P3、Ins1,3,4,5-P4およびPtdIns4,5-P2(図4)に対して脱リン酸化活性を示し、イノシトール1,3,4-三リン酸(Ins 1,3,4-P3)に対する活性を示さなかったことから、SynaptojaninやPIPPと同じType IIのIP5Paseであることが示された。SKIPはPtdIns 4,5-P2に対して、他のType II IP5Paseに比べて非常に高い活性(Km＝180M)を示したが、Ins 1,4,5-P3に対しては6倍以上低い活性(Km＝1.15mM)しか示さなかった。このことは、SKIPがPtdIns4,5-P2を特異的に脱リン酸化する酵素であることを示唆している。過剰発現させたCOS-7細胞における免疫染色の結果、SKIPは細胞質部分、中でも核周辺に集中してドット状に発現しており、その部分においてアクチンストレスファイバーの消失が見られた(図5)。また、ラット神経芽細胞であるN1E-115細胞においても、神経突起のSKIP発現部位に同様のアクチン消失が見られた。このことから、SKIPはSynaptojanin 1同様、PtdIns 4,5-P2の脱リン酸化を介してアクチン線維の構築を負に制御すると考えられる。しかし、Synaptojanin 1の様な、上皮細胞増殖因子(EGF)や血清刺激による、細胞内局在の変化は見られなかった。

図表図4 SKIP蛋白によるPtdIns-4,5-P2の脱リン酸化 SKIP蛋白によって、PtdIns-4.5-P2が脱リン酸化されて、PtdIns-4-Pが生成されている。 / 図5 COS7細胞に過剰発現させたSKIP蛋白の免疫染色図 SKIP蛋白を発現した細胞では、アクチンストレスファイバーの消失がみられている。

　SKIPはこれまでに単離されたIP5Paseの中で、最もPtdIns 4,5-P2に対する脱リン酸化活性の強い分子であり、PtdIns 4,5-P2の機能を負に制御する分子であると考えられる。また、SKIPはSynaptojanin 1やPIPP同様、IP5Pase活性を介したアクチン細胞骨格系を制御を行う分子であると考えられる。しかし、Synaptojanin 1と違い刺激依存的な変化は確認されておらず、そのシグナル伝達機構の解明は非常に重要であると考えられる。今後は、SKIPの活性化機構および、PtdIns 4,5-P2の脱リン酸化を介するアクチン細胞骨格系制御機構の解明を目指している