これまでに研究されてきたすべてのアクチンはN末端がアセチル化されている。この反応の経路に関する研究からアクチン特異的な酵素の関与が明らかになるなど、N末端のアセチル化がアクチン特異的な因子で進行することが分かってきている。これらのことはアクチンのN末端アセチル化がアクチンの機能上、重要であることを示唆しているが、具体的にはほとんど不明のままである。

　一方、これまでの研究からアクチンの配列1-4に存在する酸性アミノ酸残基が形成する負電荷クラスターがアクトミオシンATPaseのV_maxを増加させ、K_appを有意には変化させないことが分かっている。N末端のアセチル化はアミノ基のもつ正電荷を取り除くことで、アクチンN末端における実質的な負電荷の数を増やすことから、アクトミオシンATPaseに対して、同様の効果を及ぼす可能性がある。

　この可能性を検証するために、私はN末端がアセチル化されていないアクチン(非アセチル化アクチン)を調製し、生化学的な特性を野生型と比較した。非アセチル化アクチンは正常なフィラメントを形成し、ATP非存在下でミオシンサブフラグメント1(S1)と強く結合し、ヘビーメロミオシン(HMM)のATPaseを活性化した。野生型アクチンとの比較の結果、V_maxは有意に変化せず、K_appは3.6倍になった。このように、アクチンのN末端アセチル化はアクチンN末端の負電荷クラスターと異なり、アクチン・ミオシン間の弱い相互作用を強めるという独自の役割を果たしていることが分かった(1.2)。

　非アセチル化アクチンの調製は、N末端に遺伝子工学的にヒスチジンタグとfactor Xaの認識配列(-Ile-Glu-Gly-Arg-)とを付加したDictyosteliumアクチン(H₁₀Xa-アクチン)をニッケルカラムで分離した後、factor Xaを作用させることにより行った。こうして調製したアクチンのN末端はブロックされていないアミノ基を持っており、非アセチル化アクチンと同等である。

　非アセチル化アクチンの精製 H₁₀Xa-アクチンはDictyosteliumで発現し(図1A,レーン2)、Ni-NTA樹脂を用いて野生型アクチンから完全に分離できた(図1A,レーン3)。H₁₀Xa-アクチンはfactor Xaにより切断されて、非アセチル化アクチンが生じた。切断されなかったH₁₀Xa-アクチンや、ヒスチジンタグとfactor Xa認識配列とを含む断片はNi-NTA樹脂で除去できた。最後に、重合-脱重合サイククによりfactor Xaを分離した(図1A,レーン4)。

　非アセチル化アクチンは予測どおり、二次元電気泳動により野生型アクチンよりも塩基性であることが示された(図1B)。

　非アセチル化アクチンは正常に重合・脱重合した。図2に非アセチル化アクチンが形成したフィラメントの電子顕微鏡写真を示した。このフィラメントのクロスオーバー周期は36nmであるので、非アセチル化アクチンは正常なフィラメントを形成することが分かった。

　S1はATP非存在下で非アセチル化アクチンのフィラメントと共沈した(図1C)。これは非アセチル化アクチンがミオシンと硬直複合体を形成することを示している。

図1 非アセチル化アクチンの調製(A)レーン1:野生型細胞、レーン2:H₁₀Xa-アクチン発現細胞、レーン3:H₁₀Xa-アクチン、レーン4:非アセチル化アクチン(B)二次元電気泳動パターン。単矢尻:野生型アクチン、二重矢尻:非アセチル化アクチン(C)ATP非存在下での非アセチル化アクチンとS1との共沈。レーン1,3:上清、レーン2,4:沈殿。HC:重鎖、ELC:必須軽鎖

　アクチン活性化HMM ATPase活性 さまざまな濃度の野生型、または、非アセチル化アクチンの存在下でアクチン活性化HMM ATPase活性を測定した。図3にEadie-Hofsteeプロットとして結果を示した。図3において縦軸上の切片がV_maxに相当する。野生型、および、非アセチル化アクチンのV_maxはそれぞれ13.5±1.0sec^-1,17.4±2.0s^-1であった。すなわち、VS_maxの値は両アクチン間で有意な相違を示さなかった。図3の傾きは-K_appに相当する。野生型、および、非アセチル化アクチンのK_appはそれぞれ25.5±3.0M,91.9±12.8Mであった。すなわち、非アセチル化アクチンのK_appの値は野生型アクチンのその値よりも3.6倍、大きかった。これはアクチンのN末端アセチル化がアクトミオシンATPaseサイクルにおいて、アクチン・ミオシン間の弱い相互作用を強めることを表している。

図表図2 非アセチル化アクチンが形成するフィラメントの電子顕微鏡写真 Nano Van,pH8.0でネガティブ染色を行った。矢尻はフィラメントのクロスオーバー点を示し、その間隔は36nmである。スケールバー:100nm / 図3 アクチン活性化HMM ATPase活性 丸:野生型アクチン、四角:非アセチル化アクチン

　私は、アクチンN末端のアセチル化がアクト-HMM ATPaseのK_appを小さくし、V_maxにはほとんど影響を与えないことを発見した。この結果に基づいて、アクチンN末端のアセチル化による影響をアクチンのN末端負電荷クラスターによる影響と比較する。

　非アセチル化アクチンの調製 H₁₀Xa-アクチンの発現と精製に成功した。アフィニティークロマトグラフィーを用いた本研究の方法は、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いた従来法では野生型アクチンと分離できなかった変異アクチンの分離を可能にした。

　H₁₀Xa-アクチンはfactor Xaにより切断されて、非アセチル化アクチンが生じた。本研究で用いた非アセチル化アクチンは、N末端がアセチル化されていない以外は野生型アクチンと全く同一の配列をもつので、アセチル化の機能的な重要性を疑いなく明らかにすることを可能にした。

　アクチン活性化HMM ATPase活性 アクト-HMM ATPaseのV_maxはアクチンのN末端がアセチル化されているか否かにかかわらず、ほとんど変化しなかった。このことはアセチル化がミオシンATPaseの活性化能に影響を与えないことを示している。一方、非アセチル化アクチンは野生型アクチンに比べ3.6倍のK_appを示した。この結果は、アクチンのN末端アセチル化がアクチン・ミオシン間の弱い相互作用を強くするということを表している。

　これまでの研究から、アクチンの配列1-4に含まれる負電荷の個数がV_max,K_appそれぞれの大小と相関を持つことが明らかになっている。図4AはV_maxが、アクチンの配列1-4における負電荷の数が1から3の範囲で、劇的に増加することを示している。一方、図4Bに見られるように、1/K_appは大きな変化を示さない。非アセチル化アクチンは、配列1-4に持つ負電荷の数が2であるのに、野生型アクチン(配列1-4の負電荷の個数は3)とほぼ同じV_maxを持つ。このことは非アセチル化アクチンによるミオシンATPaseの活性化能が負電荷の数から予測されるよりも高いことを示している。一方、非アセチル化アクチンはずっと低い1/K_appを示した。すなわち、非アセチル化アクチンとミオシンとの弱い相互作用は予測よりもずっと弱い。この結果は、アクチンのN末端アセチル化のアクトミオシン相互作用に対する影響はアクチンのN末端負電荷クラスターによる影響とは異なることを示している。

図4 アクト-HMM ATPaseの動力学的パラメータの、非アセチル化アクチシ(四角)と野生型、または、N末端変異アクチン(丸)との間での比較V_max(A)と1/K_app(B)を野生型アクチンの値で規格化し、アクチンのN末端アミノ酸残基1-4における実質的な負電荷の個数に対してプロットした。用いた変異アクチンはD1HとD1H/D4Hである。

　アセチル化されていないN末端では-アミノ基が正電荷を持ち、疎水的なアセチル基が除去されているので、アセチル化されているN末端よりも疎水性が低くなっていると考えられる。この疎水性の低下が、弱い相互作用の予測外の低下と関係しているかもしれない。アクチンとミオシンとが弱い相互作用で結合したあとはN末端の-アミノ基が持つ正電荷が、おそらくミオシンの残基により遮蔽されて、アクチンN末端に残っている3個の負電荷がミオシンATPaseを正常に活性化できるようになるのかもしれない。これがV_maxが大きくは変化しない原因かもしれない。

　結論として、アクチンのN末端アセチル化はアクチンによるミオシンATPaseの活性化能に影響を与えることなく、アクチン・ミオシン間の弱い結合を強くする。この結果は非アセチル化アクチンに特異的であり、アクチンN末端における負電荷の変化では説明できない。

　指導教官の若林健之教授をはじめ、須藤和夫教授、安永卓生助手、佐伯喜美子技官に深く感謝する。