Ara4 GTPaseは、ゴルジ体及びその周辺の小胞に局在し、ゴルジ体近傍での小胞の融合に関与していることが、著者による修士課程における研究から明らかになっている。そこで、さらにその機能を解析するため、ARA4の発現が酵母ypt変異体に及ぼす影響を検証した。その結果、Ara4は、ypt1、ypt3、sec4、ypt6、及びypt7の、何れの変異をも相補することが出来なかったばかりか、ypt1、ypt3、sec4の各変異体において、その生育を許容温度においても著しく阻害した。さらに、その阻害は、GTP固定型であるとされるAra4^Q71Lを発現させた時に特に顕著であることも見いだされた。そこで、Ara4^Q71Lを発現しているypt1、ypt3、sec4変異体を電子顕微鏡により観察したところ、ypt1変異体では小胞体が、ypt3変異体ではゴルジ体が不可逆的に変形したBerkeley bodyと呼ばれる膜構造が、sec4変異体では分泌小胞が異常に蓄積していることが明らかとなった。このAra4タンパク質による生育阻害は、Ara4が、酵母のYptタンパク質の制御因子、もしくは効果因子を奪うことにより、それぞれの変異体の弱点が強調されることが原因の一つとなっていると考えられた。

　そこで、この生育阻害を抑圧するような遺伝子産物を探索すれば、Ara4タンパク質と機能的に相互作用する因子が得られるのではないかと考え、GAL1プロモーター下にアラビドプシスのcDNAを連結したライブラリーを作製し、それをAra4^Q71Lを発現するypt1変異体に導入し、共発現させることにより、Ara4^Q71Lによる生育阻害を抑圧できる遺伝子を探索した。その結果得られたcDNAの中の一つは、GDP解離抑制因子(GDI)のホモログをコードしていたので、AtGDI1と名付けた。AtGDI1は、酵母のGDI変異体であるsec19-1の温度感受性を37度まで相補することができ、確かに機能的なGDIをコードしている。この遺伝子は、アラビドプシスの各組織で発現していることも判明した。

　一方、上記のAtGDI1 cDNAをプローブに用いたサザン解析の結果より、アラビドプシス中にはAtGDI1のアイソザイムが数個存在することが明らかとなった。それらのアイソザイム間でどのような機能的分化がなされているかを解析することは、単細胞である酵母に1コピーのみ存在するRabGDIが、高等植物内でどのように多様化しているかを解明する糸口となると考えられる。そこで、AtGDI1をプローブに用いてアラビドプシスcDNAライブラリーをスクリーニングし、AtGDI1とは異なる新たなRabGDIをコードするcDNAを得た。AtGDI2と名付けたこの遺伝子産物は、AtGDI1とは91%相同であり、酵母sec19-1変異株の温度感受性を相補できることから、これもAtGDI1同様、確かにRabGDIとして機能することが明らかとなった。また、AtGDI2は、Ara4^Q71Lによって引き起こされるypt1変異体の生育阻害を、AtGDI1と同様に抑圧することができた。このことは、Ara4^Q71Lが、AtGDI1、AtGDI2の双方と相互作用し得ることを示している。さらに、ノザン、及びサザン解析の結果から、AtGDI2は、AtGDI1と若干の発現パターンの違いはあるものの、やはりアラビドプシスの各組織で発現しており、AtGDI1、AtGDI2の他にも、さらに1コピーのGDI遺伝子がアラビドプシス中に存在することも判明した。

　これまでのRabGDIの解析から、RabGDIの細胞内での機能は、GTPを加水分解し終えGDP結合型となったRabのみを膜から解離させ、次のGTPase cycleを開始するまで細胞質中に保持しておくことであるとされている。一方、本研究においてAra4^Q71Lとして使用したGlnからLeuへの置換は、GTPase活性が低下する変異として、様々な低分子量GTPaseにおいてGTP固定型として汎用されているものであるにも関わらず、上記のように、Ara^Q71LとAtGDI1が相互作用するという結果を得た。これは、RabGDIがRab-GDPとのみ相互作用し得るという定説に反するものである。そこで、Ara4^Q71Lと、AtGDI1及びAtGDI2が、酵母内で本当に複合体を形成しているかを調べるため、抗AtGDI1抗体を用いて免疫沈降を行った。その結果、Ara4^Q71LはAtGDI1の存在に依存して、抗AtGDI1抗体により沈降することが示された。この結果は、Ara4^Q71LとAtGDI1が、酵母内で複合体を形成していることを生化学的にも支持する。なお、AtGDI2も同様に、Ara4^Q71Lと酵母内で複合体を形成していることが確認された。

　以上のGDIとは別に、先のスクリーニングで得られた第二の抑圧因子についても解析を行った。No.6と呼んでいるこの遺伝子は、中央とC末端にcoiled-coil構造を持つことが予想されるタンパク質をコードしていた。これは、これまでにホモロジーのある遺伝子が報告されていない新規のものであったが、中央部分には酵母の液胞タンパク質の輸送に関与するVps27と相同性を示す領域を有していた。

　以上AtGDI1、No.6といった因子を明らかにした上で、Ara4のGTPase cycleを、酵母内で素過程に分割して解析するため、様々な変異(S26N、T44A、Q71L、△C等)をAra4に導入し、それらの変異Ara4がypt変異体の生育に及ぼす影響を解析した。その結果、少なくとも3種類の酵母内の因子が、Ara4によって奪われ、ypt変異体の生育を妨げていることが判明した。そこで、2種の抑圧因子が、その3種の因子のうち何れのものに対応するかを調べる目的で、それぞれの変異Ara4による生育阻害に対するAtGDI1とNo.6の抑圧活性を検討した。その結果、Ara4とAtGDI1との相互作用は、Ara4C末端のCysモチーフに依存的であるが、No.6とAra4の相互作用はこれに依存せず、さらに、この相互作用がAra4のThr⁴⁴付近の効果器領域にも依存しないことが判明した。さらに、少なくとももう1つの因子が、酵母内でAra4に奪われていることが判明した。今後この方法を応用し、Ara4 GTPaseの周辺で機能する因子の解析をさらに進めることにより、Ara4が植物の小胞輸送において果たす役割を明らかにできると期待している。

　1)植物細胞内の小胞輸送経路を司るRab/Ypt GTPaseに関し、その制御、もしくは情報伝達機構に関与する遺伝子、AtGDI1、及びNo.6を、酵母を用いた新規の相互作用因子探索法により単離した。

　2)GTP固定型となるGlnからLeuへの変異を導入したAra4^Q71Lが、RabGDIはRab-GDPとのみ相互作用し得るというこれまでの定説に反し、AtGDI1、及びAtGDI2と複合体を作り得ることを、遺伝学的、及び生化学的に示した。

　3)AtGDI2を単離し、これがAtGDI1と同様Ara4と相互作用することを示した。

　4)様々な変異を導入した変異型Ara4を利用し、酵母内でAra4のGTPase cycleを素過程に分割できることを示したとともに、その系を利用し、AtGDI1もしくはNo.6と、Ara4との相互作用様式を明らかにした。