TFL1-Aをクローニングするにあたり、既知の転写因子を調べたところ、site Aにホモロジーのある配列に結合する因子がすでにクローニングされていた(表1)。YY1、、NF-E1、UCRBPはそれぞれ別個にクローニングされたが同じタンパク質である(以下YY1とする)。そこでこのYY1がL1のsite Aを認識するかどうか調べた。

　YY1を単離し、lac Zとの融合タンパク質(rYY1)として大腸菌でつくらせた。このrYY1をsite Aを含むプローブでgel shift assayを行ったところ、rYY1を含む大腸菌抽出液だけにシフトしたバンドがみられた。このバンドは、self-competitionで消失したが、site Aを変異させたcompetitorでは消失しなかったことから、rYY1は特異的にsite Aを認識結合することが示された。

　次にrYY1とTEL1-Aの認識配列を詳細に解析するために、プローブを3塩基ずつ置換したオリゴをcompetitorとしてgel shift assayを行ったところ、rYY1とTFL1-Aは同じbinding profileを示し認識配列は同一であった。また、HeLa細胞核中のYY1で同様の実験をしたところ、YY1もまたTFL1-Aと同じ配列を認識した。

　最後に抗-YY1抗体を使いgel shift assayを行ったところ、TFL1-A-site A複合体によるバンドはスーパーシフトした。さらに抗-YY1抗体のエピトープをもつペプチドを加えたところスーパーシフトは形成されなかった。

　以上の結果よりL1のsite A結合因子TFL1-Aはpol II転写因子のYY1であることが明らかにされた。

表1 site Aにホモロジーのある認識配列とその結合因子

　さらにYY1がL1の転写に関与していることを直接示すためYY1を除去したHeLa核抽出液(YY1 depleted extract)を調整しin vitro transcription assayを行った。使用した鋳型は図2に示している。その結果、YY1を除去しないときと比較してL1の転写活性は有意に減少した。またYY1 depleted extractに部分精製してきたYY1を加えたところ、少しではあるがL1のプロモーター活性は増加した。これらの結果より、YY1がL1の転写に関与していることが明らかになった。

　メチル化によって転写が抑制される遺伝子は数多く知られている。またL1においてもプロモーター領域のメチル化とL1の発現パターンに逆相関があることが報告されており、L1もまたメチル化によって転写が抑制される遺伝子の一つであることが考えられる。そこでメチル化によりL1の発現が抑制されるのかを直接明らかにするために、transfection assayおよびin vitro transcription assayを行った。

　site Aを含むL1配列をCATの上流にもつコンストラクト(pCAT155L1)を作成し、CpG methylaseでメチル化し(MepCAT155L1)、HeLa細胞にtransfectionした。メチル化の基質を除いて反応(モックメチル化)したのをコントロールとした。その結果コントロールに比較して、メチル化したコンストラクトのCAT活性は減少した。さらにベクター由来の配列にCpG配列が1つもない鋳型L1NS(図2)を用いてin vitro transcription assayを行った。メチル化したL1NSの転写活性は阻害されたがモックメチル化したL1NSの転写活性は阻害されなかった。以上の結果よりL1の転写はメチル化により抑制されることが明らかになった。

図2.in vitro transcription assayで用いた鋳型

　この実験で用いた鋳型にCpG配列は7つある。そこでこの7つのCpG配列の内どのCpG配列が転写抑制に必要なのかより詳細に解析した。site specificにメチル化するために、CpG配列をカセット変異法でメチル化できない配列にある組合わせで置換した(表2)。CpG methylaseでメチル化した後in vitro transcription assayを行ったところ、+42から+72までのCpGをメチル化したときのみL1の転写が抑制された(表2、L1FOUR)。またこのうち1つでもメチル化されなかった時はL1の転写が抑制されなかった(表2、L142+52,L142+58,L142+61,L142+70)。つまりL1の転写抑制には4つのCpG(+52,+58,+61,+70)がメチル化されることが必要十分であることが示された。

表2.置換の組合わせとメチル化による転写活性+はCpG配列でメチル化されることを示している。-はCpG配列をメチル化されない配列に置換したことを示しメチル化されない。転写活性はメチル化したときの転写活性である。

　メチル化による転写抑制のメカニズムは大きく二つに分けることができる。1つは転写活性化因子の結合がメチル化によって直接または間接的に阻害されるメカニズム、もう1つはmethyl-C binding protein(MeCP)の結合によって転写が阻害されるメカニズム、である。この両方の可能性について検討した。

　site Aをもつプローブをメチル化してcompetitorとしてgel shift assayを行ったところ、YY1-site A複合体のバンドは消失した。またin vitro transcription assayで使用した鋳型(図2)をメチル化してcompetitorとしたところ同様にバンドは消失した。以上の結果はYY1はメチル化しているcompetitorに結合できることを示しており、メチル化によりYY1のsite Aへの結合は阻害されないことが明らかになった。

　次に、MeCPsの関与を調べるためにCAT活性をもたないプラスミドをメチル化し(methylated competitor)、MepCAT155L1とco-transfectionした。この実験は、MepCAT155L1に結合しL1のプロモーター活性を抑制しているMeCPが、co-transfectionしたmethylated competitorに奪われ、MepCAT155L1のプロモーター活性が戻ることを予想して行ったものである。その結果methylated competitorを15倍量加えてもMepCAT155L1のプロモーター活性は戻らなかった。しかしながら、methylated competitorが細胞内のMeCPsを十分にtitration outしているかどうか分からないので、MeCPsの関与については今のところ明らかではない。

　以上の結果よりメチル化と転写抑制の関係については今後更なる解析が必要である。

　以上の結果をまとめると

　1)L1のsite A結合因子TEL1-Aはpol II転写因子のYY1である。またL1の転写にYY1は関与している。

　2)L1の転写はメチル化によって抑制され、その抑制には4つのCpG sitesがメチル化されることが必要十分である。

　3)メチル化にかかわらずYY1がsite Aに結合することから、メチル化によるL1転写抑制の分子機構についての明確なモデルを立てるには至っていない。