非相同的組換えの頻度は、非相同的組換えによって形成されることが知られている形質導入ファージ bioの形成頻度を求めることによって測定することにした。そして、このファージの形成頻度はSpi^-の性質を示すファージを検出することにより求めた。(以下、 Spi^-アッセイと呼ぶ。) Spi^-アッセイは、以下の原理で非相同的組換えを検出する。ファージは、大腸菌ゲノムのgal遺伝子とbio遺伝子の間に存在するattB領域に溶原化する。溶原化したファージが切り出される際に、まれに異常な切り出しが起こり、ファージに隣接する大腸菌ゲノムのgal遺伝子かbio遺伝子を取り込んだ特殊形質導入ファージ( gal、 bio)が形成される。このうち bioは、 red gam^-となることが多く、この redgam^-は、P2ファージ溶原菌(P2溶原菌)においてプラークを作ることができる。この表現型をSpi^-という。一方、正常な切り出しを経て形成された野生型ファージは、P2溶原菌においてプラークを作ることができない。このP2溶原菌におけるプラークの形成能の違いを利用し、 Spi^-を検出する。実際の実験は、以下に示す手順で行なった。溶原菌を対数増殖初期まで培養し、紫外線照射後、熱誘発を行なった。得られた溶菌液を、野生型大腸菌とP2溶原菌にプレートし、それぞれで得られるプラーク数から全ファージ数と Spi^-ファージ数を計測した。全ファージ数に対する Spi^-ファージ数の割合を Spi^-の形成頻度とし、これを非相同的組換えの頻度とした。組換え体の組換え部位の分布は、PCRによって確認した。PCRの鋳型には、互いに独立になるように集めた Spi^-を用いた。またプライマーとしては、大腸菌及びファージのゲノム上に適当な間隔で分散配置したオリゴヌクレオチドの中から適当な2本のオリゴヌクレオチドを用いた。

　相同的組換えやDNA修復に関与する因子が、非相同的組換えに関与するかどうか、関与するのであれば、それがどのように関与するのかを調べるために、各種の大腸菌rec変異株を用いて、 Spi^-アッセイを行ない、その変異が Spi^-の形成頻度にどのような影響を与えるかを調べた。その結果、一本鎖DNA特異的5’→3’エキソヌクレアーゼをコードするrecJ遺伝子の変異株(recJ284::Tn10)において、紫外線照射条件下で、 Spi-の形成頻度が野性株に比べて1/3から1/10に低下することがわかった(図1)。このことから、RecJエキソヌクレアーゼがこの非相同的組換えに促進的に関与していることが示された。また、紫外線照射条件下、野性株で形成される Spi^-の組換え部位には、短い相同な配列が存在することが確認された。このことから、RecJエキソヌクレアーゼが―本鎖DNAを生成し、短い相同性を有する領域同士がアニールすることで、組換え体の形成が促進されることが示唆された。

図1.大腸菌594株におけるrecJ284::Tn10変異の非相同的組換えに与える影響

　野生型大腸菌で形成される Spi^-のうち半数以上が、大腸菌とのゲノム上にそれぞれ一カ所存在する組換えの高発部位(ホットスポット)での組換えによって生成することが示されている。 Spi^-の形成に促進的に関与するRecJエキソヌクレアーゼが、このホットスポットでの組換えにどのように関与するかを調べた。紫外線照射条件下で、野性株、recJ変異株のそれぞれから Spi^-を集め、その組換え部位の分布をPCRによって解析した。その結果、野性株で形成された Spi^-の63%が、ホットスポットでの組換え産物であることが確認された(図2)。しかし、recJ変異株から得た Spi-においては、ホットスポットでの組換え産物が2%しかなく、recJ変異によってホットスポットでの組換えが抑制されていることがわかった(図2)。このことは、RecJエキソヌクレアーゼが、ホットスポットにおける組換えにも選択的に関与していることを示している。紫外線によるDNAの損傷に起因するDNA鎖切断が相同性のある部位の近傍で起こり、そこでRecJエキソヌクレアーゼが作用するためのこの酵素の選択的関与が観察されると考えられる。

図2.野生株(a)、recJ284::Tn10変異株(b)から得られた組換え体の組換えジャンクションの分布

recJ変異株で得られた Spi^-の解析

　紫外線照射条件下recJ変異株で得られた Spi^-の組換え部位の塩基配列を決定した。その結果、大部分の組換え部位には、3から13bpの相同性があることが確認された。この結果と、 Spi^-の形成がrecJ変異により完全に抑えることができないという結果は、RecJエキソヌクレアーゼ以外のエキソヌクレアーゼがこの組換えに関与している可能性を示唆している。

　一本鎖DNAに特異的なRecJエキソヌクレアーゼが効率的にその活性を発揮するためには、二本鎖DNAを巻き戻してRecJエキソヌクレアーゼの基質となる一本鎖DNA部分を作るヘリカーゼが必要であり、かつ Spi^-の形成にRecJエキソヌクレアーゼと共に促進的に関与しているのではないかと考え、3’→5’ヘリカーゼをコードするrecQ遺伝子の変異株(recQ1802::Tn3)について調べた。その結果、予想とは逆にrecQ変異株においては、紫外線照射条件下で Spi^-の形成頻度が野性株に比べて約3倍に上昇した(図3)。さらに、紫外線非照射条件下での、recQ変異株における Spi^-の形成頻度は野性株に比べ約30倍に上昇した。このことは、RecQヘリカーゼが紫外線の照射、非照射によらず非相同的組換えに抑制的に働いていることを示している。この結果から、非相同的組換えを誘起するDNAの損傷、または異常な構造を修復する機構にRecQヘリカーゼが、関与していること、組換え体の形成の後期の段階で形成されていると考えられる、RecJエキソヌクレアーゼによって形成された一本鎖領域同士が相補性を持つ領域間でアニールしたものをRecQヘリカーゼが破壊すること、といった可能性が示唆された。この効果は、特に、紫外線非照射条件下で顕著に現れることもわかった。

図3.大腸菌594株におけるrecQ1802::Tn3変異の非相同的組換えに与える影響

recQ変異株で形成された Spi^-の解析

　紫外線非照射条件下、recQ変異株において形成された Spi^-の組換え部位の分布を調べた。その結果、62%が山口らの報告した組換えのホットスポットでの組換え産物であることが確認された。紫外線非照射条件下、Spi-の形成頻度がrecQ変異により野生株の約30倍になることを考えると、RecQヘリカーゼは少なくともホットスポットでの組換えを特異的に抑制していると考えることができる。

recJ recQ二重変異株で形成された Spi^-の解析

　紫外線照射条件下、recJ recQ二重変異株において形成された Spi^-の組換え部位の分布を調べた。その結果、35%がホットスポットでの組換えによって形成されたものであった。これは、recJによるホットスポットでの組換えの低下をrecQ変異が抑制したことを意味する。これは、RecQヘリカーゼがRecJエキソヌクレアーゼの関与するDNAの末端がプロセスされる段階においても関与していることを強く示唆している。RecQヘリカーゼが組換え体の形成の後期の段階で形成されていると考えられる、RecJエキソヌクレアーゼによって形成された一本鎖領域同士が相補性を持つ領域間でアニールしたものを破壊することで非相同的組換えを抑制していると考えられる。

　1) 相同的組換えとDNA修復に関与していることしか知られていなかったrecJ遺伝子産物(一本鎖DNA特異的5’→3’エキソヌクレアーゼ)が、紫外線によって促進される非相同的組換えに促進因子として関与していることがはじめて明らかにした。

　2) RecJエキソヌクレアーゼが、形質導入ファージの形成の際に見られるホットスポットでの組換えに選択的に関与していることを示した。

　3) recQ遺伝子産物(3’→5’ヘリカーゼ、RecQヘリカーゼ)が、紫外線の照射、非照射によらず非相同的組換えに抑制因子として関与していることが明らかにした。

　RecJエキソヌクレアーゼの作用によって形成された一本鎖DNA間に短い相補性が存在すると、その領域間でアニールが起こり組換え体の形成が促進されると考えられる。また、RecQヘリカーゼは、一本鎖領域同士が相補性を持つ領域間でアニールしたものを破壊することで非相同的組換えを抑制していると考えられる。