微胞子虫類が、SrRNA分子の配列情報に基づいて分類が可能であるか検討するために、グルゲアとヘテロスポリスのSrRNAの塩基配列を決定し、データベースに登録されている他の11種の微胞子虫類のSrRNAとの比較を試みた.ディプロモナス類のGiardia lambliaとHexamita inflataをアウトグループにして、微胞子虫類13種をアラインメントし、791サイトを最尤法で解析した(図1).まず、系統樹の枝分かれは高いブートストラップ確率で支持されており、曖昧さが少ない.次に、同属に分類されている種が近縁となっており、従来からの分類法と一致している.さらに、グルゲアはヘテロスポリスと近縁であることが示され、属より上位の分類段階での系統関係の推定にはSrRNAなどの分子を用いる方がわかりやすい.このようにSrRNAの系統樹が微胞子虫類の分類方法の1つとして有用である可能性が示された.SrRNAはPCRによる増幅が比較的容易であること、微胞子虫類の分子のデータでは最も豊富であることから、今後は微胞子虫類の分類にSrRNAの情報を併用するのがよいと考えられる.

図1 SrRNAの塩基配列に基づく微胞子虫類の系統樹.Giardia lambliaとHexamita inflataは、ミトコンドリアのない原生生物でアウトグループとして用いた.

真核生物のなかでの微胞子虫類の位置・・・EF-1に基づく解析

　EF-1は原核生物のEF-Tuに相当し、翻訳反応に必須の蛋白質である.全ての生物細胞にその相同蛋白質が存在し、進化速度が遅く保存的であることから、真核生物全体の系統関係を推定するなど古い時代から長期間にわたって分岐してきた生物の系統推定に適した材料と考えられている.さらにEF-1/Tuは多くの生物種で配列が報告されているため系統推定には好都合である.RT-PCR法を用いて増幅したEF-1の遺伝子断片をプローブとしてグルゲアのゲノムライブラリーをスクリーニングし、コード領域全体を含むゲノムDNAを単離し、その塩基配列を決定した.グルゲアのEF-1のコードしていると推定される領域は、イントロンがなく推定アミノ酸数は465残基であった.古細菌3種をアウトグループに各種真核生物とアラインメントし、375サイトを最尤法で解析した.その結果、EF-1の配列が公表されている真核生物のなかで、グルゲアが最も早く他の真核生物に至る系統から分岐したことが明確に示された(図2).

　SrRNAの塩基配列に基づく解析では微胞子虫類の系統的位置がはっきりしなかったが、EF-1のアミノ酸配列に基づく解析では、微胞子虫類が真核生物で最も初期に分岐したことが明瞭に示された.ただし、これはあくまでも1つの蛋白質分子を解析した結果でしかない.分子にはそれぞれ固有の進化の歴史があるため、一つの分子から生物の系統を推定するのは危険である。そこでさらにEF-2のアミノ酸配列から分子系統学的解析を行うこととした。EF-2は、全ての細胞に相同な蛋白質が存在し(原核生物ではEF-G)、ペプチド鎖伸長反応に必須で、進化の過程で保存された蛋白質である.

　グルゲアのゲノムライブラリーから、EF-2のコード領域全体を含むゲノムDNAを単離し、その塩基配列を決定した.グルゲアのEF-2は、EF-1.同様にイントロンはなく、推定アミノ酸数は848残基であった.古細菌をアウトグループに各種真核生物とアラインメントして、542サイトを最尤法で解析した.その結果、EF-1同様にグルゲアが真核生物の進化の歴史の最も初期に分岐したことがブートストラップ確率100%で明確に示された.

　EF-1およびEF-2の解析では、グルゲアを含めミトコンドリアを持たない原生生物(図2で*の付いた種)が、真核生物の進化の初期に分岐している.これらの原生生物はミトコンドリアが共生する以前に分岐したのか、それとも一旦獲得したミトコンドリアを後に失ったのかは今回の解析からはわからない.

図2 EF-1のアミノ酸配列に基づく系統樹.Glugea plecoglossiが真核生物の中で最も早い時期に分岐している.*はミトコンドリアのない原生生物.

真核生物のなかでの微胞子虫類の位置・・・EF-1とEF-2の解析に基づく総合評価

　2つの保存的蛋白質、EF-1およびEF-2のアミノ酸配列に基づく解析では、現在これらの蛋白質の配列データの公表されている種のなかで、グルゲアは他の真核生物に至る系統から最初に分岐したことがはっきりと示された.さらにこれら個別の分子の解析結果を総合的に評価すると、グルゲアが真核生物のなかで最も初期に分岐した生物であることがより明瞭となった.

　今後は微胞子虫類のこのような特徴を念頭において、微胞子虫類症の治療および予防法を開発して行くことが重要な課題と考えられる.

　微胞子虫類が、SrRNA分子の配列情報に基づいて分類が可能であるか検討するために、グルゲアとウナギに寄生する微胞子虫類Heterosporis(Pleislophora)anguillarum HoshinaのSrRNAの塩基配列を決定し、データベースに登録されている他の11種の微胞子虫類のSrRNAとの比較を試みた。アウトグループのディプロモナス類2種と微胞子虫類13種をアラインメントし、791サイトを最尤法で解析した。その結果、系統樹の分岐は高いブートストラップ確率で支持され曖昧さが少なく、同属に分類されている種が近縁となり従来からの分類法と一致した。つまりSrRNA分子の系統樹が微胞子虫類の分類方法の1つとして有用である可能性が示されたと考えられる。SrRNAは、PCRによる増幅が比較的容易であり、微胞子虫類の分子のデータでは最も豊富であることから、今後は微胞子虫類の分類にSrRNAの配列情報を併用するのがよいと考えられる。

EF-1およびEF-2から推定した真核生物の内部での微胞子虫類の位置

　EF-1は原核生物のEF-Tuに相当し、翻訳反応に必須の蛋白質である。全ての生物細胞にその相同蛋白質が存在し、進化速度が遅く保存的であることから、古い時代から長期間にわたって分岐してきた生物の系統推定に適した材料と考えられている。RT-PCR法を用いて増幅したEF-1の遺伝子断片をプローブとしてグルゲアのゲノムライブラリーをスクリーニングし、コード領域全体を含むゲノムDNAを単離し、その塩基配列を決定した。グルゲアのEF-1のコードしていると推定される領域は、イントロンがなく推定アミノ酸数は465残基であった。古細菌3種をアウトグループに各種真核生物とアラインメントし、375サイトを最尤法で解析した。その結果、グルゲアが最も早く他の真核生物に至る系統から分岐したことが明確に示された。

　EF-1のアミノ酸配列に基づく解析では、微胞子虫類が真核生物で最も初期に分岐したことが明瞭に示されたが、分子にはそれぞれ固有の進化の歴史があり、一つの分子のみから生物の系統を推定するのは危険であるため、さらにEF-2のアミノ酸配列から分子系統学的解析を行うこととした。EF-2は、全ての細胞に相同な蛋白質が存在し(原核生物ではEF-G)、ペプチド鎖伸長反応に必須で、進化の過程で保存された蛋白質である。グルゲアのゲノムライブラリーから、EF-2のコード領域全体を含むゲノムDNAを単離し、その塩基配列を決定した。グルゲアのEF-2は、EF-1同様にイントロンはなく、推定アミノ酸数は848残基であった。古細菌をアウトグループに各種真核生物とアラインメントして、542サイトを最尤法で解析した。その結果、EF-1同様にグルゲアが真核生物の進化の歴史の最も初期に分岐したことが明確に示された。

　2つの保存的蛋白質、EF-1およびEF-2のアミノ酸配列に基づく解析では、現在これらの蛋白質の配列データの公表されている種のなかで、グルゲアは他の真核生物に至る系統から最初に分岐したことが独立にはっきりと示された。さらにこれら個別の分子の解析結果を総合的に評価すると、グルゲアが真核生物のなかで最も初期に分岐した生物であることがより明瞭となった。

　以上、本論文はアユに寄生する微胞子虫グルゲアについて、その分類に関し貴重な新知見を得るとともに、治療法にも示唆を与えるもので、学術上・応用上貢献するところが少なくない。よって、審査員一同は本論文が博士(農学)の学位に値すると判断した。