生物個体が恒常性を維持しながら生存する上で、自己と非自己を明確に分かつことは必須であり、異物の侵入から生体を防御する機構を備えることは極めて重要であると考えられる。

　脊椎動物とは異なり抗体産生能を持たない昆虫では、生体防御の一つの機構として、幼虫体液中の血球凝集素や抗菌蛋白質等による異物排除が示されつつある。例えばセンチニクバエ(Sarcophaga peregrina)の幼虫ではグラム陰性菌に有効なザルコトキシンとグラム陽性菌に有効なザーペシンという抗菌蛋白等が見いだされている。これらは体壁傷害の刺激でその遺伝子の発現を介して合成が誘導され、侵入したバクテリアの細胞膜に致死的に作用することにより異物の排除に協調的に働くことが明らかにされている。

　昆虫のもつ生体防御機構を更に解明する目的で私はセンチニクバエの成虫より新たな抗菌物質を検索したところ、未知の活性画分を見出し精製した。更にこの新規化合物の構造と作用メカニズムの解析を行ったので、以下に報告する。

　センチニクバエ成虫より抗菌活性を誘導させるために成虫腹部に大腸菌K-12594(str^r)株を塗布した針で傷をつけた。27℃で16時間飼育した後、プロテアーゼ阻害剤のアブロチニンを含む0.1%TFAを加え、ホモジナイズした。超遠心操作後、その上清をろ過して精製の出発材料とした。次にステップワイズで逆相カラムクロマトグラフィーを行った。この段階で既にセンチニクバエの幼虫から精製された抗菌蛋白群とは異なる活性画分を得た。続いてこの活性画分をHPLCシステムによりC₁₈逆相カラムクロマトグラフィー、carbon-500順相カラムクロマトグラフィーを行い、活性と対応する単一のピークを得た(Table 1)。

Table 1. Summary of purification of 5-S-GAD

　高分解能FAB-MS分析の結果、この抗菌物質は分子量が574.1804(M+H)⁺で、分子組成式がC₂₂H₃₁N₅O₁₁Sの化合物であることがわかった。この分子式はESCA,¹³C-NMR,¹H-NMR分析等の分光学的解析でも確認された。

　DQF-COSYとHOHAHAスペクトルによりスピン系を解析し、又、¹H-¹³CHSQCにより水素と炭素との相関を決定した。その結果、部分構造としてグルタミン酸、グリシン、-アラニン、システイン、3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン(ドーパ)を持つことが分かった。この結果は、アミノ酸組成分析の結果と合致していた。

　更に、HMBCスペクトルで観察されたlong range couplingの解析によりこれらのアミノ酸の結合様式を解析した。また、¹H-¹⁵NHSQCによりグルタミン酸と-アラニンが1級アミンとして存在することが分かった。これらの解析から最終的にこの物質は新規のペプチド性化合物、N--アラニル-5-S-グルタチオニル-3,4-ジヒドロキシフェニルアラニンであることが明らかとなった(Fig.1)。以下、この抗菌物質を5-S-GADと表記する。

　決定した5-S-GADの構造が正しく、これが抗菌活性を有する実体であることを確認する目的で、化学的手法及び酵素反応を用いて5-S-GADの合成を行った。先ず液相法によりN--アラニルドーパを合成した。次にキノコのチロシナーゼを用いた酵素反応によりグルタチオンとドーパの5位炭素との間にスルフィド結合を導入し、最終的に5-S-GAD合成に成功した(Fig.2)。

図表Fig.1 Structure of 5-S-GAD / Fig.2 Scheme of Synthesis of N--Alanyl 5-S-Glutathionyl Dopa

　合成品とハエからの精製標品とを同時にC₁₈逆相HPLCにて分析した結果、同じ溶出時間に検出された(Fig.3)。UV、IR、旋光度、NMR、FAB-MS等の他の分光学的データも一致した。次に抗菌活性の比較を行った結果、同じ非活性を示した(Fig.4)。このことより決定した5-S-GADの構造は正しく、そのもの自体が抗菌物質であることを明らかにした。

図表Fig.3 RP-HPLC profile of 5-S-GAD / Fig.4 Comparison of antibacterial activity of synthesized and purified 5-S-GAD

　5-S-GADの作用メカニズムを知る目的で、まず抗菌スペクトルを調べた。その結果、E.coli K-12 594(str^r)に加え、M.luteus FDA16やS.aureus IFO12732の増殖を各々26M、17M、31Mの濃度で50%阻害した。これより、5-S-GADは、グラム陽性菌のみならず陰性菌にも作用することが分かった。

　5-S-GADの既知の構造類似体に関する抗菌活性は知られていないが、メラノーマ患者より過剰代謝される5-S-システイニルドーパ(以下、5-S-CDと略す)については抗腫瘍活性を持ち、その作用はH₂O₂の発生を介することが知られている。そこで、 5-S-GADの 抗菌活性の作用メカニズムもH₂O₂を介しているのではないかと考え、H₂O₂を加水分解する酵素カタラーゼを添加して、 5-S-GADの抗菌活性を調べた。その結果、添加量依存に抗菌活性が減少し、 カタラーゼ125g/mlを加えることにより5-S-GAD30g/mlの抗菌活性は完全に消失した(Fig.5)。 これより、5-S-GADの抗菌活性はH₂O₂を介する事が強く示唆され、既知の抗菌蛋白の作用機序とは異なる事が明らかとなった。

Fig.5 Effect of catalase on the antibacterial activity of 5-S-GAD

　更に、5-S-CDと同様の抗腫瘍活性を有する可能性についてMTT法で調べた結果、Ehrlich、IMC ca細胞など、いくつかの癌細胞株の増殖を有意に阻害することが分かった。

　センチニクバエ成虫から大腸菌への抗菌活性を指標に、新しい抗菌物質を分離、精製した。この物質は、分子量573の新規のペプチド性化合物、N--アラニルー5-S-グルタチオニル-3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン(5-S-GAD)であり、合成5-S-GADを用いた解析から、この構造が抗菌活性をもつ実体であることを明らかにした。更に5-S-GADの作用メカニズムは既知のセンチニクバエ合成の抗菌蛋白群とは異なり、H₂O₂を介して殺菌的に作用することを示唆した。

　5-S-GADの構造から考察すると、この化合物は既知の抗菌蛋白のように遺伝子発現を介して合成されるのではなく、2次的に代謝され生合成されるものと考えられる。昆虫の感染防御機構の一つとしてフェノール酸化酵素の活性化が知られている。この知見に加え、センチニクバエでは、体表障害時に抗菌蛋白を合成する組織、脂肪体の細胞内のグルタチオン濃度が減少すること、体液中に-アラニルチロシンが存在することを考慮すると、5-S-GADはグルタチオンと、-アラニルチロシンとからフェノール酸化酵素により合成されると考えられる。

　また、抗菌蛋白の遺伝子発現に、H₂O₂により活性化される転写因子が関与することが解析されつつある。5-S-GADは、それ自身が抗菌活性を有する以外に、他の生体防御機構の活性化にも関わるkey moleculeである可能性が指摘できる。今後、 5-S-GADの生物学的意味の解明は単に無脊椎動物にとどまらず、生物一般の生体防御機構の理解を探究する上においても重要な手がかりになると考える。