ラット卵巣20-HSD cDNAのクローニング

　ラット卵巣での20-HSDは完全精製されていて、分子量37kDaであること、等電点の異なる2種類の分子(20-HSD1と20-HSD2)からなること、20-HSD1の19個のアミノ酸配列がラット肝臓3-水酸化ステロイド脱水素酵素(3-HSD)、ウシ肺プロスタグランジンF合成酵素のアミノ酸配列と部分的に一致していることが報告されている。これら情報をもとにしてラット卵巣20-HSDのcDNAクローニングを行った。

　20-HSD cDNAを多く含むcDNAライブラリーを作製するために、ウマ絨毛性性腺刺激ホルモン(eCG)/ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン(hCG)処置をして多数の黄体を形成させた卵巣mRNAを用いた。20a-HSDのアミノ酸配列をもとにして作製したプライマーでPCRを行い、スクリーニングのためのプローブを準備した。PCR産物(567bp)は20-HSD1のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含んでいたことから、20-HSD cDNAのスクリーニングに用いてクローン(pHSD12-07)を得た。

　クローン(pHSD12-07)のcDNAがコードするアミノ酸配列は、ラット卵巣20-HSD1の19個のアミノ酸配列と完全に一致する配列を含んでいた。そして、このcDNAがコードするタンパク質は20-HSD活性をもつこと、ラット卵巣20-HSDの特異抗体と反応することが明らかになった。また、20-HSD2は20-HSD1とわずかに異なるアミノ酸配列をもっているので、得られたcDNAはラット卵巣20-HSD1 cDNAと判定された。このcDNAは1.2kbの塩基配列からなり、323個のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードしていることが明らかになった。そのアミノ酸配列はウサギ卵巣20-HSDの他に、ラット肝臓3-HSD、ウシ肺プロスタグランジンF合成酵素、ヒト肝臓クロルデコン還元酵素、カエルレンズpクリスタリン、哺乳類のアルドース還元酵素のアミノ酸配列と高い相同性があった。これら分子はアルドケト還元酵素群に属していて、ラット卵巣20-HSDもこの一員であることが示唆された。

ラット卵巣20-HSD1の遺伝子及び活性の発現調節

　ラットでは黄体のプロゲステロン分泌能の獲得には、下垂体から分泌されるPRL(プロラクチン)が必須である。これまでの研究で、PRLのプロゲステロン分泌促進作用は20-HSD活性の抑制であることが明らかになっている。PRLの分泌がない場合、黄体では20-HSD活性が誘導されプロゲステロン分泌能を獲得しない。また、妊娠や偽妊娠の後期ではPRLの有無に関わらず20-HSDの活性は上昇する。従って、ラット黄体の20-HSD活性に着目すると、PRLが存在すると活性が抑制されるPRL依存期(黄体相初期と中期)と、PRLの存在に関係なく活性が増加するPRL非依存性期(黄体相後期)が存在することになる。そこで、性腺刺激ホルモン(eCG、hCG、PRL)とPRLの分泌を抑制するブロモクリプチンを組み合わせて投与した幼若ラットの卵巣について、Northern BlotとWesternBlotにより経時的に20-HSD1 mRNAと酵素タンバク量を調べ、20-HSDの発現誘導機構と抑制機構の解析を試みた。

　ラット卵巣における20-HSD1 mRNAの発現は、eCGで開始されhCGによってさらに増加することが明らかになった。また、PRLによる20-HSD活性抑制はmRNAレベルで起きていることも明らかになった。性腺刺激ホルモンによる20-HSD1 mRNAの上昇は第9日目まで認められ、その後急激に増加した。hCG投与後9日目まではPRL依存的に20-HSD活性が抑制される時期にあり、その後はPRL非依存的であると考えられる。第3日から第6日にかけて行った実験ではブロモクリプチンにより20-HSD活性は上昇し、その上昇はPRL投与で完全に阻止できた。PRL依存性の時期(9日目まで)にはmRNA量、酵素タンパク量、酵素活性がよく相関し、主に20-HSD1 mRNAの転写が20-HSD酵素タンパク質の合成の律速となっていることがわかった。一方、PRL非依存性の時期(第12日目以降)にはこれらの相関が崩れ、第12日目の酵素タンパク量は第9日目と変わらないものの20-HSD1 mRNA量は著しく増加し、20-HSDの発現には多段階の調節が行われていることが示唆された。

ラット20-HSD1の組織特異的発現

　ラットでは20-HSD活性は卵巣以外に胎盤などの組織で検出されている。また、20-HSD活性はラット以外の動物種でも報告されているが、そのほとんどが卵巣以外の組織である。従って、20-HSDは黄体の機能化や維持の制御の他に、別な生理的な機能をもつことになる。しかし、これら組織での20-HSDとラット卵巣由来の20-HSD1とはアミノ酸配列などの構造が相関しているのかどうかを調べる必要がある。

　成熟ラットの様々な組織での20-HSD1 mRNAの発現をNorthernBlotとRT(Reverse Transcription)-PCRで調べた。これとは別に妊娠各期の卵巣、子宮、胎盤、胎仔における20-HSD1 mRNAの発現も同様の方法で調べた。

　20-HSD1 mRNAは正常性周期ラットの卵巣で最も多く発現していることが確認された。発現量は極めて少ないが脳、肝臓、腎臓、子宮でも20-HSD1 mRNAの発現が観察された。一方、ステロイド産生器官である副腎や精巣ではその発現が認められなかった。胎盤で20-HSD1 mRNAの発現が12日目から20日目まで認められた。さらに子宮と胎仔でも発現していることが明らかになった。卵巣以外で発現している組織では、ステロイド分泌の調節よりもむしろステロイドの作用が及ばないように調節している可能性が考えられる。また、ラット卵巣由来の20-HSD1はウサギ卵巣由来の酵素を除くと、他の動物種の20-HSDとは分子発生学的大きく離れていることを示していた。齧歯類を除く動物種では、ラット卵巣由来の20-HSDと1次構造や基質親和性が似ている分子は発現していない可能性がある。

ラット卵巣20-HSD1の分子進化

　ラット卵巣20-HSDの機能や構造を解析するために、アルドケト還元酵素の分子系統樹を構築した。ラット卵巣20-HSDは系統的にアルドケト還元酵素のタイプ2の酵素群に分類された。そして、20-HSD1は同群のラット肝臓3-HSDとは1次構造だけでなく、Chou-Fasman解析による2次構造でも類似していた。3-HSDはステロイドだけでなく胆汁酸や発ガン性物質などを基質とする多機能性の酵素で、様々な組織で発現する遺伝子群を構成している。ラット卵巣20-HSDはその遺伝子群の中の1つを起源としている可能性がある。そして、ラット卵巣20a-HSDの立体構造はアルドケト還元酵素に共通な/バレル構造で、基質の認識にはC末端側のシステイン残基が関係していることが予想される。

　本研究では、ラット卵巣から20-HSD1 cDNAのクローニングに成功した。卵巣での発現は性腺刺激ホルモンによってmRNAレベルで制御されていて、その後20-HSD活性が上昇する時期には転写・翻訳・活性レベルで多段階の調節を受けていることが示唆された。20-HSDの構造や起源はアルドケト還元酵素と関連していることが明らかになった。本研究によって、20-HSDの発現調節機構を遺伝子レベルで解析することが可能になった。