細胞性がん遺伝子c-srcは非受容体型チロシンキナーゼをコードし、本来増殖のシグナル伝達に関わる重要な遺伝子として細胞周期のG0/G1またはG2/M期の移行に関与すると考えられている。一方、がん遺伝子v-srcはそのC末端側制御領域を欠失し、活性型となって常に増殖シグナルを与えることによってがんを引き起こす。本研究ではまず、このv-srcでトランスフォームされたラットの線維芽細胞(SR-3Y1)を用い、その増殖シグナルを遮断することにより細胞周期の進行をG1期またはG2期で停止させる化合物を土壌微生物培養液中より探索した。その結果、カビの一種KF9株の培養液中にG1、G2期停止を誘導すると同時にv-srcトランスフォーム細胞の形態を正常化する活性を見い出した。そこで菌体のアセトン抽出、酢酸エチ抽出、シリカゲルカラムクロマト、HPLCを行って活性物質KF9-Aを単離した。KF9-Aは¹H-及び¹³C-NMR、EI-MS、UV、IR等機器分析により抗カビ抗生物質として報告されていたラディシコール(C₁₈H₁₇O₆Cl,分子量364)であると同定した(図1)¹⁾。

図1。ラディシコールの構造式

　フローサイトメトリーによる解析からラディシコールはラット正常線維芽細胞3Y1の細胞周期をG1、G2両期で可逆的に停止させ、そのG2停止の解除から細胞の倍数化を引き起こすことが判明した。細胞周期の進行は、サイクリンA、Eに代表されるG1サイクリンに結合したCdkによってG1/S移行が、サイクリンBに代表されるG2サイクリンと結合したcdc2キナーゼによってG2/M移行が実行される。そこでラディシコールによって引き起こされる細胞周期停止がこのようなCdk活性の阻害に起因するかどうかをCdkに結合するp13^suc1およびサイクリンA抗体を用いて解析した。まず、p13^suc1ビーズで回収される全Cdk活性に対してラディシコールが直接阻害しないことを確かめた上で、S期同調培養、対数増殖培養にラディシコールを加えた時の細胞内Cdk活性を調べたところ、サイクリンA-Cdk2、サイクリンB-Cdc2によるキナーゼ活性がともに阻害されていることがわかった。このことからラディシコールがCdkの活性化の過程を阻害し、結果として細胞周期のG1、G2期停止を誘導することが示唆された。

　ラディシコールは細胞周期阻害作用と同時に、処理後12時間という短時間のうちにv-srcトランスフォーム細胞形態を扁平化し、細胞内に正常細胞の特徴であるアクチンストレスファイバーの再形成を誘導した。このような形態変化の原因としては、v-src遺伝子産物であるp60^v-srcのチロシンキナーゼ活性を直接阻害することが考えられる。そこでp60^v-src抗体による免疫沈降や抗ホスホチロシン抗体によるイムノブロットによって細胞内p60^v-srcのチロシンキナーゼ活性に対するラディシコールの作用を調べたところ、処理後3時間目から薬剤濃度依存的にp60^v-srcの自己リン酸化量が減少し、24時間後にはほぼ完全に自己リン酸化を阻害した。また、細胞内のp60^v-srcの基質といわれているカルパクチンIなどのチロシンリン酸化も強く阻害されていた。一方、p60^v-src蛋白自身の量は特に減少していなかったことから、ラディシコールは細胞内Src系チロシンキナーゼの活性を強力に阻害することが示唆された。さらにアフィニティー精製したp60^v-srcの活性をin vitroで阻害することも明らかにした。これに対しA-キナーゼ、C-キナーゼ、EGF受容体のチロシンキナーゼ、MAP-キナーゼなど他のセリン・スレオニンあるいは受容体型チロシンキナーゼに対してはほとんど阻害作用を示さなかったことから、ラディシコールがSrc系チロシンキナーゼに特異的な阻害剤であると結論した²⁾。

　低分子量G蛋白質をコードするがん遺伝子rasは、srcなどの非受容体型チロシンキナーゼ、EGF受容体などの受容体型チロシンキナーゼなどの信号を核に伝える重要な因子であり、ヒトのがんにおいて多数の変異が認められている。もしラディシコールがRasの上流に位置するSrc系チロシンキナーゼのみを特異的に阻害するのであれば、rasが活性化したトランスフォーム細胞の形態には影響しないと考えられる。そこでv-Ha-rasトランスフォーム細胞や活性型変異Rasが発現しているヒトの膀胱がん細胞T24に対するラディシコールの効果を観察したところ、予想に反してrasトランスフォーム細胞でも細胞周期の停止とともに形態の正常化が観察された。このことは単純なSrcキナーゼの阻害だけでは説明がつかない。Rasの機能に対するラディシコールの作用を調べるために、細胞内RasのGDP/GTP結合比率および細胞膜局在性に及ぼす影響を観察した。GTP結合型のRasが活性型であるので、もし、ラディシコールがRasの活性を抑えるのであればGTP結合型が減り、GDP結合型が増えるはずであるが、そのような変化は認められなかった。また、ファルネシル化による細胞膜局在にも影響はなかった。これらの結果から、ラディシコールはRas蛋白の機能を直接阻害しないと結論した。また、このようなv-Ha-rasトランスフォーム細胞の形態正常化誘導活性は別のチロシンキナーゼであるハービマイシン処理によっても確認され、Ras信号伝達経路の下流にチロシンキナーゼが関与している可能性が示唆された³⁾。そこでさらにRasの下流で機能すると考えられるがん遺伝子v-raf、v-fosでトランスフォームした細胞やRas信号伝達とは直接関係ないと考えられるDNAウィルスSV40でトランスフォームした細胞の形態に及ぼす効果を検討したところ、いずれの細胞に対しても形態を正常化し、アクチンストレスファイバーの再形成を誘導した。このことは、ラディシコールによる形態正常化はがん化に関連する信号伝達の阻害ではなく、むしろがん抑制遺伝子のような正常化因子の誘導によって引き起こされることを示唆する。そこで様々な代謝阻害剤とラディシコールを共存させ、ラディシコールの形態正常化活性の抑制の有無を検討したところ、ラディシコールによる形態正常化活性は他のプロテインキナーゼ阻害剤、呼吸、脂肪酸代謝阻害剤によっては抑制されないが、actinomycinD、cycloheximideのようなRNAや蛋白合成阻害剤によって抑制されることがわかった。すなわちラディシコールによる形態正常化には新たな遺伝子発現と蛋白合成が必要であると考えられる。

　ラディシコールによる癌細胞の形態正常化には新たな蛋白質合成が必要であることが明らかになったので、ラディシコールによって誘導される蛋白を同定する目的で2次元電気泳動によって解析したところ、分子量約90kDa蛋白質の増加を観察した。この90kDaの蛋白質は分子量と等電点よりアクチン調節蛋白質ゲルゾリンである可能性が考えられた。ゲルゾリンは分子量92kDaで全てのほ乳動物の細胞質と血清に存在し、アクチンの重合と脱重合を制御する因子として知られている。特に最近、ある種の腫瘍細胞が分化する際にゲルゾリンのmRNAが増加することやrasトランスフォーム細胞のリバータントでも高発現していることなどが報告され、がん抑制因子としての可能性も指摘されている。そこでヒト抗ゲルゾリン抗体を用いて免疫沈降やウェスタンブロットあるいはフローサイトメトリーを行い、この蛋白がゲルゾリンであることを確認した。さらにノーザン解析によりゲルゾリンの発現誘導が転写レベルで起こることも明らかになった。一方、他の細胞骨格蛋白質であるアクチンやビンクリン、あるいは、ゲルゾリン以外のアクチン調節蛋白質である-アクチニン、ADF(Actin Depolymerizing Factor)、プロフィリンなどの増加は認められなかった。また、ビメンチンに代表される中間径フィラメントなどの蛋白質の合成にも影響がなかった。このようなラディシコールによるゲルゾリン発現誘導がその形態正常化作用に必要であるかどうかを明らかにするため、抗ゲルゾリン抗体をT24やHeLa細胞にマイクロインジェクションすることを試みた。あらかじめ抗ゲルゾリン抗体を注射した細胞ではラディシコールの効果はほぼ完全に抑制されたが、対照として用いたマウスIgGやバッファーを注射した細胞では抗ゲルゾリン抗体が示したような抑制効果は認められなかった。また、ゲルゾリン遺伝子のcDNAを発現型ベクターに導入し高発現させたところ、その細胞形態が正常化することも確認された。

　一方、分化誘導物質として再発見され、その標的分子がヒストン脱アセチル化酵素であることが証明された細胞周期阻害剤トリコスタチンA(TSA)も、種々の腫瘍細胞に対し新たな蛋白合成に依存して形態変化を誘導することが知られている。そこでTSAのゲルゾリンの発現に及ぼす作用を免疫沈降、ウェスタンブロット、ノーザンブロットによって調べたところ、ゲルゾリン遺伝子転写の活性化が起こり、対照の10〜15倍のゲルゾリン蛋白の合成誘導が確認された⁴⁾。このTSAによるゲルゾリン発現誘導も抗ゲルゾリン抗体のT24やHeLa細胞へのマイクロインジェクションによってラディシコールの場合と同様、その効果がほぼ完全に抑制されるのが確認された。ラディシコール、TSAという異なる阻害剤によって共通にゲルゾリンの発現が誘導されるとともにがん細胞形態の正常化が誘導されるということから、ゲルゾリンが形態正常化に重要な役割を果たしていることが強く示唆された(図2)。

図2。ラディシコールのがん細胞正常化モデル

　以上本研究により細胞周期阻害剤として単離されたラディシコールが、(1)Src系キナーゼを強力に阻害すること、(2)様々ながん遺伝子でトランスフォームした細胞、ヒトがん細胞に対して新たな蛋白合成に依存して形態の正常化を誘導すること、(3)アクチン調節蛋白質ゲルゾリンがラディシコールによって発現誘導される蛋白の一つであること、(4)ゲルゾリンの発現誘導がその形態変化の原因として考えられることが明らかになった。このような研究成果を通じて現在ラディシコールの生理作用は世界的にも注目を集め、共同研究者らにより新たな生物活性として、骨髄性白血病細胞の分化誘導作用⁵⁾、マクロファージの誘導型シクロオキシゲナーゼの発現阻害による抗炎症作用⁶⁾、血管新生抑制作用が明らかになるとともに、そのジパルミトイル誘導体による強力な制がん作用も報告され、臨床応用も期待されるに至っている。これらの作用がすべてSrc系チロシンキナーゼの阻害に由来するかどうかについては今後検討する必要があるが、細胞周期阻害を出発点とした探索研究が有益な化合物を提供しうる例を端的に示したものと考えられる。